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副溶血性弧菌是一种常见的食源性致病菌,是近几年来引起食物中毒事件的最主要微生物之一。副溶血性弧菌主要存在于海水、鱼、虾、贝类等海产品中,其引起的食物中毒临床上以腹痛、呕吐、腹泻等为主要症状。溶血毒素是副溶血性弧菌的主要致病因子。TLH、TDH和TRH是副溶血性弧菌分泌的三种主要溶血毒素,分别由tlh、tdh和trh基因编码。其中TLH为副溶血性弧菌所特有,而TDH、TRH与其致病性紧密相关。为了给建立副溶血性弧菌的免疫学检测平台的建立提供材料基础,本研究分别以重组的副溶血性弧菌溶血毒素和灭活菌体为抗原制备副溶血性弧菌特异性抗体。一、副溶血性弧菌主要溶血毒素原核表达体系的构建本文通过克隆重组构建了副溶血性弧菌主要溶血毒素TLH、TDH和TRH原核表达载体pET30a/tlh、pET30a/tdh和pET30a/trh,并将它们转入E. coli BL21中诱导表达出重组蛋白His-TLH、His-TDH和His-TRH,成功构建了TLH、TDH和TRH原核表达体系。二、副溶血性弧菌特异性单克隆抗体的制备首先以TDH重组蛋白为纯化对象,从纯度、回收率以及免疫原性方面比较分析了重组表达蛋白的镍柱亲和层析法和割胶回收法。结果显示利用割胶回收法纯化所得重组蛋白纯度高且具有较好的免疫原性。因此本文利用割胶回收法纯化了TLH、TDH和TRH重组表达蛋白抗原。通过免疫、融合与克隆筛选,最终成功分别获得了TLH和TDH的特异性抗体细胞株各1株。经特异性分析,两株抗体细胞株分泌的TLH-DB2和TDH-AC12单克隆抗体对各自抗原的特异性反应良好,但为实现直接检测副溶血性弧菌培养上清的目的。三、副溶血性弧菌特异性多抗的制备以紫外灭活的副溶血性弧菌菌体为抗原,经免疫、效价检测、纯化,最终获得了副溶血性弧菌的多克隆抗体。多抗的ELISA检测结果显示制备所得多抗对副溶血性弧菌具有较强的特异性反应,同时对单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌也有较弱的交叉反应。四、副溶血性弧菌特异性抗体的应用可行性本文以制备所得抗体为材料制备了免疫磁珠,对副溶血性弧菌的快速富集和TLH重组蛋白的快速检测进行了初步的应用探讨。结果显示,以本研究制备的兔抗血清建立的IMS-PCR检测技术可以实现对副溶血性弧菌的快速分离检测,在未优化的情况下,该法的副溶血性弧菌检测限约为10~3 CFU;以TLH-DB2单克隆抗体建立的免疫层析试纸条检测法可以检测TLH重组蛋白,并实现对其定量检测(检测限0.01μg)。