碳纳米管及电化学修饰玻碳电极在DNA损伤研究中的应用

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生物电分析化学是电分析化学与分子生物学的交叉学科,是当今分析化学的热点内容之一。DNA的电化学研究始于20世纪50年代,早期的工作主要集中于DNA的基本电化学行为的研究。随着极谱学的发展,其他电分析化学方法也应用于DNA的研究,DNA的研究范围也逐步扩大到DNA的结构和形态分析、DNA探针、传感器的制备以及DNA与其它小分子,尤其是能识别特定碱基序列的小分子或一些药物分子之间的相互作用研究等方面。 DNA中只有碱基具有电化学活性,鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)可以在汞电极上发生电还原反应,而鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)可在各种固体电极上电氧化,所以可以利用DNA自身碱基氧化还原信号的变化来说明DNA结构的变化。DNA的氧化损伤,可导致基因突变、细胞功能紊乱、细胞坏死甚至引发癌症,8-羟基鸟嘌呤是一种公认的DNA氧化损伤的生物标记物。另外,DNA与抗癌药物之问的相互作用研究,不论是对阐述抗癌药物的作用,还是对致癌机理的研究都具有非常大的意义。 本研究的特色是利用电化学修饰或一种新型纳米材料—单壁碳纳米管修饰玻碳电极,研究DNA及其嘌呤碱基在两种修饰电极上的电化学行为,DNA氧化损伤生物标志物-8-羟基鸟嘌呤核苷在纳米管修饰电极上的高灵敏度电化学检测、抗癌药物6-巯基嘌呤在该修饰电极上的电化学行为及其与DNA的相互作用等。DNA氧化损伤及损伤产物的直接电化学检测目前研究较少,开展这方面的工作,不仅对于研究DNA在生命过程的电子传递具有十分重要的理论意义,而且可以为研究DNA的损伤机理、DNA损伤与患癌危险性之间的关系,提供有力的帮助,对于预测肿瘤的发生发展具有一定的指导意义。主要内容如下: 1.嘌呤碱基、核苷及DNA在电化学预处理玻碳电极上的恒电流计时电位溶出测定研究了鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、鸟嘌呤核苷(dG)、腺嘌呤核苷(dA)和热变性、酸消解小牛胸腺DNA(CT-DNA)在电化学预处理玻碳电极上的恒电流微分计时电位溶出行为。实验结果表明:电化学预处理玻碳电极方法简单、效果明显,预处理玻碳电极对嘌呤及其核苷和DNA的吸附富集能力大大增强,用恒电流微分计时电位溶出法可得到各自灵敏的溶出峰,其溶出峰高(dt/dE)与浓度在一定范围均呈良好线性关系,可用于嘌呤碱基及其核苷的定量检测和DNA浓度的测定。本方法应用于酸变性DNA样品中鸟嘌呤与腺嘌呤的同时测定,选择性好、灵敏度高;该方法还可获得有关DNA损伤的一些信息。 2.鸟嘌呤、鸟嘌呤核苷在单壁碳纳米管修饰玻碳电极上的电化学行为及其测定考察了鸟嘌呤(G)和鸟嘌呤核苷(dG)在单壁碳纳米管修饰玻碳电极(SWNTs/GCE)上的电化学行为,建立了分别或同时测定G和dG的简单而实用的方法。在含有G和dG0.1molL-1pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中,于+0.3V处富集120秒,可以得到分离很好的两个氧化峰,峰电位分别为+0.70V和+0.94V。G的氧化峰电流与浓度在3.4×10-8molL-1-5.1×10-7molL-1和5.1×10-7molL-1-2.9×10-6molL-1的范围分别成良好线性关系,相关系数分别为0.9989和0.9992;而dG的氧化峰电流与浓度在6.9×10-8molL-1-5.1×10-7molL-1和5.1×10-7molL-1-5.1×10-6molL-1的范围分别成良好线性关系,相关系数分别为0.9983和0.9990。二者的检测限分别1.1×10-8molL-1和2.8×10-8molL-1(信噪比为3)。利用该方法修饰电极操作简单,对G和dG的吸附富集非常有效,与裸玻碳电极相比,可以有效阻止其电氧化产物在电极上的吸附污染,使用过程中SWNTs/GCE的重现性和稳定性较好。 3.8-羟基鸟嘌呤核苷在单壁碳纳米管修饰玻碳电极上的电化学行为及其测定利用循环伏安法考察了8-羟基鸟嘌呤核苷(8-OH-dG)在单壁碳纳米管修饰玻碳电极(SWNTs/GCE)上的电化学行为。8-OH-dG在电化学活化的SWNTs/GCE上的电化学氧化过程为两个电子、两个质子的反应机理。在0.1molL-1pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中,8-OH-dG的氧化峰电流与浓度在5.0×10-9molL-1-1.0×10-7molL-1和1.0×10-7molL-1-1.0×10-6molL-1的范围分别成良好线性关系,相关系数分别为0.9986和0.9997,检测限为1.38×10-9molL-1(信噪比为3)。另外,考察了溶液pH值、扫描速度和尿酸干扰对8-OH-dG电化学行为的影响。结果显示,电化学活化后的功能化SWNTs/GCE能够应用于高浓度尿酸存在下8-OH-dG的高选择性、高灵敏度检测,结果令人满意。 4.6-巯基嘌呤在单壁碳纳米管修饰玻碳电极上的电化学行为及其与DNA相互作用研究利用循环伏安法研究了抗癌药物6-巯基嘌呤(6-MP)在单壁碳纳米管修饰玻碳电极(SWNTs/GCE)上的电化学行为,及其与小牛胸腺DNA(CT-DNA)的相互作用。实验发现该修饰电极对6-MP的氧化还原具有较强的催化作用,与裸玻碳电极相比,氧化还原峰形得到很大改善,峰电流明显增大。加入CT-DNA使之在恒温条件下(37.5℃)充分作用约1小时后,6-MP在SWNTs/GCE上的氧化还原峰电流明显减小,说明在缓冲溶液中它们之间发生了较强的相互作用。此外,我们还研究了6-MP的紫外吸收光谱性质,得到与电化学基本一致的结论,结果满意。
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