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在现代生物医学对于某一基因的研究中,常常因为试验目的和试验系统的需要在不同的载体表达同一目的基因,如需要获得大量高纯度蛋白时往往要在有纯化标签的原核或昆虫表达载体中插入目的基因,而当需要研究其在细胞内部或表面的生物学功能时,又需要在真核表达载体中插入目的基因。而由于不同载体的多克隆位点迥异,若每更换一次载体,都需要从头构建,经历引物设计,在上下游引物中引入酶切位点,PCR扩增,酶切,连接,转化,筛选和测序比对等诸多分子克隆操作,过程繁琐复杂;且PCR扩增目的片段时,易出现碱基突变,导致分子克隆前功尽弃,需要重头进行,严重延缓实验进程。为了解决这一问题,实现同一目的基因在多种不同载体间的快速切换,本课题组设计了系列载体的改造方案。其基本策略是:以pEGFP-C1的多克隆位点(multiple clone site,MCS)替换需改造系列质粒的原有MCS。由于pEGFP-C1的MCS仅有不到100bp,如此短的片段酶切后纯化回收困难,得率低,损失大,故在其EcoRI处,先插入一段238bp的无关辅助片段,再用此延长的MCS取代被改造载体的原有MCS,将延长的238bp的辅助片段切除后即构建成功。本课题主要完成pTriEx-4 neo载体的改造工作。1. pTriEx-4 neo/MCS-238重组体的构建和克隆以pEGFP-C1/238为模板,PCR扩增已加长238bp的pEGFP-C1的多克隆位点片段(命名为MCS-238),并在MCS-238片段的两端分别引入EcoR V和Bsu36 I酶切位点。对MCS-238片段的PCR产物和pTriEx-4 neo载体分别进行EcoR V和Bsu36 I双酶切,酶切回收PCR产物和载体,以T4 DNA连接酶进行连接,转化DH5α感受态细菌,挑选阳性克隆。2.阳性克隆的鉴定验证阳性克隆,结果显示:重组质粒经EcoR V和Bsu36 I双酶切得到约320bp的目的片断,与所连接的PCR片段大小一致。证明pTriEx-4 neo/MCS-238重组质粒构建成功,已将pEGFP-C1/238载体的MCS-238成功置换入pTriEx-4 neo载体中。3. 238bp延长片段的切除和pTriEx-4 neo/C1重组体的构建将pTriEx-4 neo/MCS-238重组体中的238bp延长辅助小片段经EcoRI单酶切去除。连接转化后通过菌落PCR初步鉴定后,经DNA测序分析显示改造后的pTriEx-4 neo载体中移植入的pEGFP-C1载体多克隆位点序列无突变,pTriEx-4 neo /C1载体构建成功(C1代表pEGFP-C1的MCS)。结论:本课题将pEGFP-C1的多克隆位点成功置换入pTriEx-4 neo载体中,替换其原有的MCS,完成部分本课题组的载体改造工程:即包括pTriEx-4 neo在内的各种常用载体的多克隆位点的标准化和统一化。本工作为实现目的基因在pcDNA3.1(+),pTriEx-4 neo,pET-28a(+)和pEGFP-C1等各类本室常用载体之间方便快捷的转移,为本课题组开展以分子克隆为基础的各项科研提供了重要的实验材料。TNF-α(tumor necrosis factor,TNF-α)是一种具有多种生物学效应的细胞因子,在免疫应答与炎症反应中起着重要作用,控制着细胞分化、增殖与凋亡。在体内以两种形式存在:跨膜型(Transmembrane TNF-α, TM-TNF-α)和分泌型(Secreted-TNF-α,S-TNF-α)。TM- TNF-α是S-TNF-α的前体,比S-TNF-α多一段76个氨基酸组成的的信号肽。TNF-α转化酶(TACE)可在跨膜TNF-α的胞外结构域切割TNF-α,释放出S-TNF-α。两型TNF-α具有不同的生物学功能,病理状态下,炎症病灶处S-TNF-α常常过量表达,如类风湿关节炎和Crohn’s病等自身免疫病,过量的S-TNF-α是该类疾病最显著的症状之一,也是临床治疗干预的主要切入点。本室的前期工作获得了一株全新的抗跨膜TNF-α的单克隆抗体C1,它只能通过识别跨膜TNF-α的TACE酶切位点结合跨膜TNF-α,而对S-TNF-α无亲和力。该株单抗的优点是能选择性结合跨膜TNF-α,通过空间位阻阻止TACE对于跨膜TNF-α的酶切,从而减少S-TNF-α的生成,而同时又不封闭TM-TNF-α的功能结构域,因此具有独特的抗炎作用方式。鼠源性抗体无法直接应用于人体,因此抗体的基因工程改造,如嵌合化和人源化是单抗用于人体试验和治疗的必经之路,本课题的目的是克隆并测序得到鼠源母本C1单克隆抗体可变区基因序列,并初步构建其人鼠嵌合抗体,为后续抗体人源化奠定基础。一.单克隆抗体C1轻链可变区基因的克隆与测序选用家族特异性的鼠免疫球蛋白轻链先导肽简并引物VL5’2与骨架四区简并引物VL3’(JK1/2)配对,PCR成功扩增出390bp大小的单克隆抗体C1轻链可变区基因目的条带,对C1轻链可变区基因C1-VL5’2核苷酸序列进行测序,结果经NCBI IgBLAST和IMGT V-quest等免疫球蛋白生物信息学工具分析得到V/J框内重排的结果:即无终止密码子出现,确认为有功能的轻链可变区重排序列。二.单克隆抗体C1重链可变区基因的克隆与测序选用家族特异性的鼠免疫球蛋白重链先导肽简并引物VH5’1与骨架四区简并引物VH3’(JH1/3)配对,PCR成功扩增出396bp大小的单克隆抗体C1重链可变区基因目的条带,将C1重链可变区基因C1-VH5’1核苷酸序列测序结果经NCBI IgBLAST和IMGT V-quest等免疫球蛋白生物信息学工具分析,得到V/D/J框内重排的结果,即无终止密码子出现,确认为有功能的重链可变区重排序列。三. C1人鼠嵌合抗体pIRES表达载体的构建与表达应用重叠延伸PCR方法将C1轻链可变区基因与人kappa链恒定区基因融合构建C1嵌合轻链基因,插入pIRES的多克隆位点A;将C1重链可变区基因与人gamma 1链恒定区基因融合构建C1嵌合重链基因,插入pIRES的多克隆位点B。ELISA检测转染pIRES-C1表达载体的CHO细胞培养上清中的嵌合抗体表达,得到阳性结果,提示嵌合抗体表达载体构建成功,顺利表达并分泌人鼠嵌合抗体。结论:成功克隆抗跨膜TNF-?单克隆抗体C1轻链及重链可变区基因,经序列分析证明为一对功能性免疫球蛋白可变区基因。利用重叠延伸PCR法成功构建pIRES单启动子双顺反子嵌合抗体表达载体,并在哺乳动物表达体系(CHO细胞)中表达嵌合抗体。