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冠状病毒(Coronavirus,CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒亚科,可分为α、β、γ、δ四个属,其中α、β冠状病毒主要感染哺乳动物,γ-冠状病毒主要感染鸟类,δ-冠状病毒既可以感染鸟类,也可以感染哺乳动物。自2003年严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)爆发以来,对冠状病毒的研究受到高度重视。近年来,不断有新的冠状病毒被发现,如2012年出现的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV),2014年在美国爆发的猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV);而且,随着环境条件变化或免疫压力等因素的影响,一些老的冠状病毒也发生了变异,导致新的变异毒株出现和流行,如2010年底在我国大流行的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)变异毒株。这些新发与再现的冠状病毒,给人类和动物健康造成构成了巨大威胁,并且造成了巨大的经济损失。核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)是冠状病毒的主要结构蛋白,也是冠状病毒编码蛋白中表达丰度最高的蛋白,在病毒的复制与免疫调节中发挥重要作用。以前的研究发现SARS-CoV、鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus,MHV)的N蛋白具有抑制I型干扰素(Interferon,IFN)的功能,但其作用机制不清楚。本研究对可以感染哺乳动物的三个冠状病毒属的代表性病毒,包括PEDV(α-CoV)、SARS-CoV和MHV(β-CoV)、PDCoV(δ-CoV)的N蛋白抑制I型IFN产生的机制进行研究。主要研究内容与结果如下:1.PEDV N蛋白抑制I型干扰素产生的机制以PEDV变异毒株AJ1102株的基因组RNA为模板,克隆了N蛋白基因并构建了真核表达质粒,转染细胞后发现超表达N蛋白能显著抑制仙台病毒(Sendai virus,SEV)诱导的IFN-β启动子活性以及IFN-βmRNA和蛋白的表达,而且抑制IFN信号通路中关键转录因子IRF3以及NF-?B中的激活,提示PEDV蛋白具有拮抗IFN-β产生的特性。进一步分析了诱导IFN产生的RLR(RIG-I-like receptor)通路中的信号分子(RIG-I、MDA5、IPS-1、TRAF3、TBK1、IKKε、IRF3等)对N蛋白拮抗IFN-β产生的影响,发现PEDV N蛋白能抑制TBK1/IKKε及其上游分子介导的IFN-β产生,但不抑制IRF3诱导的IFN-β产生,推测PEDV N蛋白可能作用于RLR信号通路中的TBK1/IKKε或TBK1/IKKε与IRF3之间的信号分子。同时,还分析了PEDV N蛋白与RLR信号通路中各分子的相互作用,发现PEDV N蛋白仅与TBK1/IKKε存在相互作用,提示TBK1/IKKε是PEDV N蛋白的作用靶点。随后的研究证实,PEDVN蛋白通过与TBK1结合,导致TBK1与IRF3的结合能力降低,从而阻碍IRF3的磷酸化和核转运,最终导致IFN-β的产生受到抑制。2.MHV和SARS-CoV N蛋白抑制I型干扰素产生的机制PEDV属于α-冠状病毒属,而MHV和SARS-CoV属于β-冠状病毒属。为了探讨MHV和SARS-CoV编码的N蛋白是否与PEDV N蛋白采用相同的机制抑制IFN-β产生,分析了MHV和SARS-CoV N蛋白与TBK1/IKKε的相互作用,发现MHV和SARS-CoV的N蛋白均不与TBK1/IKKε相互作用,而且还发现MHV的N蛋白与以前报道的SARS-CoV的N蛋白一样,不抑制RIG-I和MDA5介导的IFN-β启动子激活,提示MHV和SARS-CoV的N蛋白可能作用于RIG-I/MDA5或其上游的激活分子,与PEDV N蛋白拮抗IFN-β产生的机制完全不同。进一步分析发现,MHV和SARS-CoV的N蛋白均不与RIG-I/MDA5存在相互作用,但与对RIG-I/MDA5具有激活作用的dsRNA结合蛋白PACT(Protein activator of the interferon-induced protein kinase)存在相互作用,而且还发现PACT可以激活RIG-I和MDA5激活的IFN-β启动子活性,但这种激活均能被MHV和SARS-CoV N蛋白抑制,提示MHV和SARS-CoV的N蛋白可能通过与PACT的相互作用从而抑制RIG-I/MDA5的激活。随后的分析发现MHV和SARS-CoV的N蛋白与PACT的相互作用是依赖RNA的,MHV和SARS-CoV的N蛋白与RIG-I/MDA5竞争性结合PACT,减弱了PACT与RIG-I/MDA5的相互作用,从而抑制了RIG-I/MDA5介导的IFN-β产生,是一种完全不同于PEDV N蛋白的作用机制。3.PDCoV N蛋白抑制I型干扰素产生的机制PDCoV属于新确定的δ冠状病毒属,也是目前δ冠状病毒属中唯一成功在体外分离到病毒的δ冠状病毒。由于是一种新发现的冠状病毒,目前对其免疫学特性知之甚少。为了探究PDCoV N蛋白是否也能像其他冠状病毒的N蛋白一样具有拮抗IFN-β产生的特性,我们首先用IFN-β启动子荧光素酶系统、荧光定量RT-PCR以及ELISA等多种方法证实PDCoV N蛋白能够抑制IFN-β产生。进一步的研究发现PDCoV N蛋白不能抑制RIG-I/MDA5及其下游信号分子激活的IFN-β启动子活性,但是能抑制SEV激活的RIG-I和MDA5活性。免疫共沉淀实验发现,与MHV和SARS-CoV N蛋白不同,PDCoV N蛋白能够与RIG-I相互作用,且相互作用区域是RIG-I与PACT或dsRNA结合的解旋酶结构域(Hel)和C端结构域(CTD)。进一步的分析发现,PDCoV N蛋白与RIG-I的相互作用导致RIG-I与PACT或ploy(I:C)的结合能力降低,从而抑制RIG-I/MDA5的激活及下游IFN-β产生。更有意义的是,PDCoV N蛋白也是一种RNA结合蛋白,并且与PACT也存在相互作用。但对PDCoV N基因的截短突变分析发现,PDCoV N蛋白抑制IFN-β产生的区域主要是其N端结构域(NTD),CTD不具有抑制IFN-β产生的功能。深入分析发现NTD主要负责N蛋白的胞浆定位和RIG-I结合等功能;而CTD主要负责N蛋白核定位和RNA结合功能,这些特征对PDCoV N蛋白抑制IFN-β产生无益。综合上述研究结果,PDCoV N蛋白拮抗IFN-β主要是通过与RIG-I的Hel和CTD结构域结合,导致RIG-I识别或结合PACT和dsRNA能力下降,抑制下游信号通路传导,最终抑制IFN-β产生。通过对PEDV、MHV、SARS-CoV以及PDCoV的N蛋白拮抗IFN-β产生机制的研究,发现不同冠状病毒属的N蛋白采用不同的策略拮抗I型IFN产生,表明冠状病毒调控抗病毒天然免疫的机制十分复杂。