研究背景与目的结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是世界上仅次于肺癌和乳腺癌的第三大常见肿瘤,在我国结直肠癌发病率和死亡率呈逐步上升趋势,位列恶性肿瘤发病及死亡第五位。深入研究结直肠癌发生发展的机制,是早期发现、早期诊断和早期治疗、降低结直肠癌发病率和死亡率的关键。越来越多的研究表明,长链非编码RNA（lncRNA）与结直肠癌的发生发展密切相关。但大部分传统的生物学研究仅以单个lncRNA的功能为重点,很难对生物系统的整体进行更为全面的阐述。因此,lncRNA在结直肠癌发生、发展中的具体机制仍需要进一步探讨。本课题利用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）方法探索与结直肠癌发生发展密切相关的基因模块,并通过构建转录因子调控网络等策略筛选与结直肠癌相关的关键lncRNA分子MIR17HG,探讨lncRNA MIR17HG对结直肠癌细胞生物学表型的影响及分子机制,同时对lncRNA MIR17HG在结直肠癌免疫治疗中的作用及可能机制进行了初步的探索。为阐明结直肠癌发病机制、发现结直肠癌患者预后的生物学标志物,进而为结直肠癌的治疗提供线索。研究方法1.通过招募6例未接受任何放疗、化疗的原发性结直肠癌患者,及6例原发性结直肠腺瘤患者,收集结直肠癌患者癌组织和配对癌旁组织,结直肠腺瘤患者腺瘤组织。采用基因芯片方法筛选在结直肠癌患者癌组织和配对癌旁组织、及结直肠腺瘤组织中差异lncRNA和mRNA表达谱。结合差异mRNA的GO分析、KEGGPathway分析,及lncRNA-mRNAWGCNA共表达调控网络分析,筛选结直肠癌发生发展过程中关键lncRNA。2.采用qRT-PCR技术在扩大的结直肠癌及结直肠腺瘤人群样本中对筛选关键分子进行验证,通过细胞候选基因siRNA或silencer转染实验对构建调控网络进行验证,构建结直肠癌组织芯片,并利用免疫组化染色（Immunohistochemistry,IHC）、原位杂交技术（In situ hybridization,ISH）检测候选关键基因与结直肠癌病人预后的关系。3.构建MIR17HG稳定敲减的结直肠癌细胞株,在此基础上分析MIR17HG对结直肠癌细胞生物学功能的影响,包括colony Formation检测细胞克隆形成、transwell小室实验检测迁移和侵袭能力,采用裸鼠荷瘤实验评估MIR17HG对结直肠癌细胞裸鼠荷瘤及肝肺转移能力的影响。构建肠条件性RELA/p65敲除小鼠,在此基础上通过诱导结肠炎症-癌转化模型、ISH、染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）、qRT-PCR等技术探索RELA对MIR17HG的转录调控作用。利用生物信息学预测数据库（miRBase和TargetScan）、双荧光素酶报告基因（DLR）、RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）等实验探索MIR17HG通过海绵吸附miR-375调控RELA分子机制。4.分析miR-17-92基因簇miRNA在TCGA结直肠癌数据库及本课题组人群结直肠癌及结直肠腺瘤患者组织中的表达情况。利用染色体位置及序列分析、MIR17HG/miR-17-5p 过表达或敲减、qRT-PCR、DLR、colony formation、transwell 小室、裸鼠荷瘤实验探索MIR17HG/miR-17-5p/BLNK作用轴在结直肠癌的发生发展中的作用。5.应用RPIseq生物信息学数据库、RNA-pull down检测MIR17HG与PD-L1蛋白结合情况。利用qRT-PCR、蛋白免疫印迹（Western Blot）、IHC等实验探索MIR17HG对PD-L1的调控机制。利用IHC探索PD-L1与结直肠癌病人预后的关系主要研究结果1.结直肠癌lncRNA与mRNA芯片的生物信息学分析1.1 结直肠癌lncRNA与mRNA芯片表达谱分析根据差异表达标准:Fold change>2,P<0.05,筛选出与正常组织相比,在结直肠腺瘤组织中上调的lncRNA共1009条,mRNA共957条;下调的lncRNA共956条,mRNA共1177条。与正常组织相比,在结直肠癌组织中上调的lncRNA共367条,mRNA共1631条;下调的lncRNA共748条,mRNA共571条。1.2 WGCNA调控网络构建根据一步法构建网络,共得到27个基因模块。其中,模块Turquoise,Yellow,Light yellow与样本类型的相关性最高。Wilcoxon分析结果显示,Turquoise,Yellow,Light yellow模块基因在结直肠正常-腺瘤-癌组织中表达依次升高或降低。对Turquoise,Yellow,Lightyellow 模块 mRNA 进行 KEGGPathway 分析,结果显示Turquoise,Yellow 基因富集在T细胞受体等免疫相关信号通路中。而Light yellow模块未富集到任何有统计学意义的信号通路。转录因子调控网络构建结果显示RELA/p65可调控模块Turquoise和Yellow基因富集的免疫相关通路9个lncRNAs和19个mRNA。2.结直肠癌发生发展中关键分子的识别2.1 RELA/p65及差异lncRNA在结直肠组织中的表达及相互调控关系验证qRT-PCR结果显示,RELA/p65,MIR17HG,LINC00460在结直肠正常组织,腺瘤组织,癌组织中表达依次升高;XLOC₀06495表达依次降低（P<0.05）。RELA/p65敲减可抑制MIR17HG在HCT15等8种肠癌细胞中的表达（P<0.01）,而且MIR17HG敲减可抑制RELA/p65在HCT15等8种肠癌细胞中的表达（P<0.001）。而对LINC00460,和XLOC₀06495进行沉默时,RELA/p65表达变化并不明显。提示RELA/p65与MIR17HG间调控网络可能在肠癌发生发展过程中发挥重要作用。2.2 RELA/p65/MIR17HG在结直肠癌中的表达及其与结直肠癌患者生存关系MIR17HG原位杂交和RELA/p65免疫组化结果显示,结直肠癌癌组织中MIR17HG、RELA/p65表达要高于自体癌旁组织（P<0.001）。相对于MIR17HG、或RELA/p65低表达的结直肠癌患者,MIR17HG、或RELA/p65高表达的结直肠癌患者生存时间降低（log-Rank P<0.01）。3.RELA/p65/MIR17HG正反馈通路在结直肠癌发生发展中的作用机制研究3.1 RELA/p65通过与MIR17HG启动子区结合促进其表达ChIP结果显示,在结直肠腺瘤和癌组织中RELA/p65可直接与MIR17HG的启动子区结合;spearman相关性分析结果表明在结直肠癌人群样本中RELA/p65与MIR17HG表达正相关（z=0.6004,P<0.001）。炎癌转化模型结果显示,肠条件敲除Rela-/-小鼠较野生Relafl/fl小鼠结肠长度长（P<0.01）、生存时间增加（log-Rank P<0.05）、结肠肿瘤形成减少（P<0.01）、病理评分降低（P<0.01）。小鼠结肠MIR17HG原位杂交结果显示,Relafl/fl小鼠MIR17HG在正常-腺瘤-癌组织中表达依次升高（P<0.001）,肠条件敲除Rela-/-小鼠中MIR17HG在正常-腺瘤-癌组织中表达差异无统计学差异,而对照Rela-/-小鼠中MIR17HG表达较同组Relafl/fl小鼠中低（P<0.001）。3.2 MIR17HG对结直肠癌细胞表型的影响MIR17HG稳定敲减组SW620和HCT116细胞,细胞克隆形成、迁移和侵袭能力降低（P<0.001）。裸鼠荷瘤实验结果显示,MIR17HG敲减可抑制SW620和HCT116细胞荷瘤及肝肺转移能力（P<0.05）。3.3 MIR17HG 作为 miR-375 的 ceRNA 间接促进 RELA/p65 表达miRBase 和 TargetScan 预测结果显示,miR-375 和 miR-2116-5p 可能与MIR17HG,及 MALT1,NFKBIE,PPPP3R1,MAP3K7 和 CBL 的 3’UTR 结合。MS2-RIP 联合 qRT-PCR结果显示,在共转染野生CV221-MIR17HG-MS2-GFP或miR-2116-5p结合位置突变的CV221-MIR17HG-MS2-GFP 和 pMS2-GFP 中,可见 miR-375 富集（P<0.01）。而共转染CV221-MS2-GFP 或 miR-375-5p 结合位置突变的 CV221-MIR17HG-MS2-GFP 和 pMS2-GFP中未见miR-375富集;而miR-2116-5p在各组中未检测到任何富集。DLR实验结果显示,miR-375可降低转染携带野生型RELA/p65 3’UTR报告基因载体细胞荧光素酶活性（P<0.001）,但对转染突变型RELA/p65 3’UTR报告基因载体细胞荧光素酶活性无影响（P>0.05）。qRT-PCR结果显示,与对照组细胞相比,MIR17HG过表达可促进RELA/p65的表达（P<0.001）。而且,在MIR17HG过表达细胞中转染miR-375 inhibitor,RELA/p65表达仍升高（P<0.001）。而相对于共转MIR17HG过表达质粒和miR-375 NC组,共转MIR17HG 过表达质粒和 miR-375 mimic 后,RELA/p65表达降低（P<0.001）。4.MIR17HG/miR-17-5p/BLNK信号轴在结直肠癌发生发展中的作用机制研究4.1 miR-17-5p在结直肠中的表达及其对结直肠癌细胞表型的影响TCGA结直肠癌数据库分析结果显示,miR-17-5p在结直肠癌癌组织中表达较正常组织中高（P<0.05）。qRT-PCR结果显示,miR-17-5p在结直肠正常组织-腺瘤组织-癌组织中表达依次升高（P<0.05）。ISH结果显示,结直肠癌癌组织中miR-17-5p表达要高于自体癌旁组织（P<0.05）。生存分析结果显示,较miR-17-5p低表达的结直肠癌患者,miR-17-5p高表达的结直肠癌患者生存时间缩短（log-Rank P<0.01）。细胞表型实验结果显示,miR-17-5p敲减SW620和HCT116细胞,细胞克隆形成、迁移和侵袭能力降低（P<0.05）。裸鼠荷瘤实验结果显示,miR-17-5p敲减可显抑制SW620和HCT116细胞荷瘤及肝肺转移能力（P<0.05）。4.2 MIR17HG通过剪切成miR-17-5p抑制其靶基因BLNK表达DLR实验结果显示,miR-17-5p可降低转染携带野生型BLNK3’UTR报告基因载体细胞荧光素酶活性（P<0.01）,但对转染突变型BLNK3’UTR报告基因载体细胞荧光素酶活性无影响（P>0.05）。qRT-PCR结果显示,沉默MIR17HG或miR-17-5p可上调BLNK mRNA的表达水平（P<0.001）,而过表达MIR17HG或miR-17-5p可下调BLNK mRNA的表达水平（P<0.001）。同时过表达MIR17HG和miR-17-5p可抑制BLNK mRNA的表达水平（P<0.001）,同时沉默MIR17HG和miR-17-5p可促进BLNK mRNA的表达（P<0.001）。而在肠癌细胞中过表达MIR17HG时,同时转染miR-17-5p inhibitor,BLNK mRNA的表达水平上调（P<0.001）;在肠癌细胞中沉默MIR17HG时,同时转染miR-17-5pmimic,BLNK mRNA的表达水平下调（P<0.01）。Spearman相关性分析结果表明在结直肠癌人群样本中MIR17HG、miR-17-5p与BLNK表达均成负相关（MIR17HG:z=-0.5807,P<0.0001;miR-17-5p:z=-0.4314,P<0.0001）。4.3 BLNK在结直肠癌中的表达及其对结直肠癌细胞表型的影响细胞表型实验结果显示,BLNK敲减SW620和HCT116细胞,细胞克隆形成、迁移和侵袭能力提高（P<0.01）。裸鼠荷瘤实验结果显示,BLNK敲减可提高SW620和HCT116细胞荷瘤及肝肺转移能力（P<0.05）。IHC结果显示,结直肠癌癌组织中BLNK表达要低于自体癌旁组织（P<0.01）。生存分析结果显示,较BLNK高表达的结直肠癌患者,BLNK低表达的结直肠癌患者预后较差（log-Rank P<0.01）。4.4 RELA/p65通过MIR17HG抑制BLNK表达miR-17-5p ISH结果显示,miR-17-5p在野生型RELAfl/fl小鼠正常-腺瘤-癌组织中表达依次升高（P<0.05）,肠条件敲除Rela-/-小鼠正常-腺瘤-癌组织中表达无统计学差异（P>0.05）。BLNKIHC结果显示,BLNK在野生型Relafl/fl小鼠正常-腺瘤-癌组织中表达依次降低（P<0.05）,肠条件敲除Rela-/-小鼠正常-腺瘤-癌组织中表达无统计学差异（P>0.05）。qRT-PCR结果显示,沉默RELA/p65可上调BLNK mRNA的表达水平（P<0.001）,RELA过表达可抑制BLNK mRNA的表达水平（P<0.001）。共转RELA/p65过表达质粒与MIR17HG silencer 或 miR-17-5p inhibitor 可促进 BLNK mRNA 的表达（P<0.001）。共转RELA/p65 siRNA与MIR17HG过表达质粒或miR-17-5p mimic可抑制BLNK mRNA的表达（P<0.001）。5 MIR17HG参与PD-L1免疫治疗机制初步探讨5.1 MIR17HG对PD-L1的调控作用RPIseq在线软件预测结果显示,MIR17HG与PD-L1蛋白存在结合的可能。RNA-pulldown实验结果表明,PD-L1蛋白可与生物素标记的MIR17HG探针结合。细胞实验结果显示,MIR17HG过表达细胞中,PD-L1蛋白表达水平上调,而MIR17HG敲减可抑制PD-L1表达。而MIR17HG过表达或敲减后PD-L1 mRNA表达水平无明显变化。免疫组化结果显示,MIR17HG敲减组裸鼠肿瘤组织中PD-L1表达较对照组肿瘤组织降低（P<0.01）;Rela-/-小鼠肠组织中PD-L1蛋白表达较Relafl/fl小鼠表达降低（P<0.01）。5.2 PD-L1结直肠癌组织芯片中的表达特征免疫组化结果显示,结直肠癌癌组织中PD-L1表达要高于自体癌旁组织（P<0.001）。研究结论:1.MIR17HG在结直肠癌发生发展过程中发挥促癌作用。2.MIR17HG可作为ceRNA分子海绵吸附miR-375,促进RELA/p65的表达;RELA/p65通过直接结合到MIR17HG的启动子区,在转录水平促进MIR17HG表达。MIR17HG/RELA/p65构成正反馈通路参与结直肠癌发生发展。3.MIR17HG可通过剪切成miR-17-5p,调控免疫相关通路中BLNK基因表达,参与调节结直肠癌发生发展。4.MIR17HG可直接与PD-L1蛋白结合,增加其稳定性,可能作为结直肠癌免疫治疗新型靶点。