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肠屏障功能与机体健康息息相关。完整的肠屏障能有效阻止肠腔中的细菌及内毒素等有害物质穿过肠粘膜进入血液。正常的人体肠道粘膜屏障一共由四个部分组成，包括了机械性屏障、化学性屏障、免疫性屏障与生物性屏障。其中又以机械性屏障最为重要，它通常是指完整的、彼此连接紧密的肠粘膜上皮结构。这类结构的基础由肠粘膜上皮细胞和上皮细胞间的紧密连接共同组成。当机械屏障受损、紧密连接蛋白丢失时，肠道通透性相应升高，细菌及其代谢物等有毒物质更易侵入循环系统，引发机体系统性炎症、免疫及代谢紊乱等不利影响。既往研究表明，肠屏障功能的受损与炎症性肠病(IBD)、感染、脓毒症、代谢综合征、肥胖等疾病密切相关。 肠道碱性磷酸酶(Intestinal Alkaline Phosphatase，IAP)是碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)的一种同工酶。它是一种经糖基磷脂酰肌醇键锚定在肠道上皮细胞顶膜处的糖蛋白，可被上皮细胞释放，进入肠腔产生相应的生物活性作用。IAP主要分布于十二指肠至末端回肠，目前研究表明IAP能够维持肠道内稳态、调节脂质底物的吸收、通过其磷酸酶具备的去磷酸化作用解除肠腔中脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和游离核苷酸毒性、抑制肠道炎症反应、参与调节肠道菌群、并可少量地跨过屏障进入循环系统当中;然而，目前关于IAP与肠黏膜屏障的研究却十分有限。本课题组的前期工作发现，当野生型小鼠禁食12h后，小鼠肠道中IAP的活性下降，而给小鼠喂养外源性IAP可改善高脂饮食引起的肠屏障受损。在此基础上我们推测，IAP可能参与了肠黏膜屏障功能的维护，对肠上皮细胞间紧密连接的完整性与功能性具有直接或间接的保护作用。 在本研究课题中，我们分别从动物学实验和分子细胞学实验两个方向着手，观察了和野生型小鼠相比，IAP基因敲除后小鼠肠通透性以及黏膜紧密连接的改变，以及喂养外源性IAP对小鼠紧密连接的影响;使用小鼠胚胎成纤维细胞(Murineembryonic fibroblast cell，MEF)原代培养技术获得稳定IAP基因敲除的鼠源细胞系;在不同的基因编辑技术基础上分别获得稳定的IAP高表达、IAP基因敲除的人源肠上皮细胞系(Caco2);随后针对不同细胞系进行紧密连接基因和蛋白的检测、单细胞屏障模型的跨膜电阻实验、以及外源IAP干预刺激实验，并对可能参与其中调控作用的相关信号通路进行筛选。旨在证实IAP对肠上皮紧密连接的保护作用，并进一步研究其具体作用的紧密连接蛋白靶点，及其涉及的分子生物学机制，为临床治疗肠道疾病延伸新的治疗思路与理论依据。 第一部分 动物实验验证IAP对紧密连接的调控作用 目的:评价IAP基因敲除或补充外源性IAP对小鼠肠通透性及紧密连接的影响，证实IAP对紧密连接的调控作用。 方法:选取8周龄的雌性C57BL/6小鼠，野生型和IAP基因敲除型（Akp3-/-）各50只，通过0.6mg/g剂量的葡聚糖FITC-dextran(4kD)灌胃或肠襻注射，2h后抽取血液标本检测其进入循环的FITC-dextran浓度，反映小鼠的肠道通透性。通过Western-blot、qPCR、HE染色、激光共聚焦、透射电镜等方法检测小鼠肠道组织的紧密连接基因和蛋白，分析野生型与IAP敲除型小鼠紧密连接的差异;并通过给野生型与IAP敲除型小鼠补充不同剂量的外源性IAP，观察紧密连接的变化。 结果:和野生型小鼠相比，IAP敲除型小鼠表现出明显升高的肠道通透性，其肠黏膜组织中的紧密连接表达与蛋白水平下调，主要表现在ZO-1、ZO-2、Occludin的减少。HE染色提示IAP敲除型小鼠存在肠黏膜上皮结构损害;电镜及激光共聚焦成像提示IAP敲除型小鼠的紧密连接结构移位，且连接蛋白分布异常。而给IAP敲除型小鼠喂养外源性IAP后，可有效改善肠上皮紧密连接结构的破坏，提高紧密连接蛋白的表达水平，改善肠通透性和屏障功能。 结论:IAP敲除型小鼠相较野生小鼠的肠通透性升高，肠黏膜上皮结构紊乱，紧密连接结构移位，ZO-1、ZO-2和Occludin蛋白表达下调。通过给IAP敲除型小鼠喂养外源性IAP能有效改善上述的系列变化。 第二部分 基于人源/鼠源细胞系研究调控IAP基因对紧密连接的影响 目的:从人源和鼠源细胞水平上，采用不同的基因编辑技术获得相应的稳定细胞系，进一步研究IAP对紧密连接的调控作用。 方法:通过Crispr/cas9技术和质粒转染技术获得稳定IAP基因敲除或高表达IAP基因的人源肠上皮细胞系(Caco2)、采用小鼠胚胎原代细胞培养法获得稳定的鼠源胚胎成纤维细胞系(MEF)，通过Western-blot和qPCR等检测确认所得细胞系的IAP基因属性。对不同的细胞系进行紧密连接相关的检测，并构建体外单层细胞屏障模型;连续一周向细胞屏障添加不同剂量的LPS/EColi/TNF-α/IAP等进行干预，监测跨上皮细胞电阻值(TEER)，分析在不同的外源性刺激下，各细胞系的单细胞屏障通透性变化，以及IAP在其中的影响。 结果: IAP基因敲除的MEF细胞中ZO-1/ZO-2/Occludin的基因表达下调，而Claudin表达水平并无显著差异。IAP高表达的Caco2细胞中ZO-1基因表达显著高于对照组，而Occludin与Claudin无显著差异。IAP基因敲除的Caco2细胞中ZO-1/ZO-2/Occludin表达量均显著降低。细胞免疫荧光成像显示，相较于对照组的Caco2细胞，IAP基因敲除型Caco2细胞紧密连接模糊不清，并伴有多处结构破坏，而高表达IAP基因的Caco2细胞间则呈现出更清晰的紧密连接结构。使用LPS/Ecoli/TNF-α刺激能显著损坏Caco2细胞形成的上皮屏障，IAP基因敲除的Caco2细胞对该类刺激更加敏感，而添加外源性IAP能显著改善这种破坏作用，维持紧密连接的正常基因表达与蛋白结构。 结论:人源/鼠源IAP基因敲除细胞均不同程度地伴有紧密链接蛋白表达下调，质粒转染诱导IAP高表达后可有效提高细胞中紧密连接蛋白表达量;IAP基因敲除后的Caco2形成单层上皮细胞屏障的速度较慢，且对LPS/Ecoli/TNF-a的刺激更加敏感;外源性添加IAP能改善LPS/Ecoli/TNF-a等对细胞紧密连接的破坏作用，促进紧密连接蛋白形成，改善黏膜屏障通透性。 第三部分 探究IAP调控紧密连接的分子机制 目的:筛选出IAP调控紧密连接的信号通路与分子生物学机制。 方法:连续三天分别使用NF-Kb/STAT3/ERK/JNK四种不同信号通路的抑制剂与外源性IAP共同对IAP基因敲除的Caco2细胞进行干预，在不同时间点获取细胞并使用Western-blot和qpcr等方法检测ZO-1/ZO-2/Occludin的表达，观察哪个信号通路抑制剂能抑制IAP对紧密连接蛋白表达的促进作用。在筛选出相关信号通路之后，使用siRNA技术进一步干预信号通路下游因子表达，分析可能参与该信号通路的关键元件，构建完整的IAP调控紧密连接的机制通路。 结果:对IAP基因敲除的Caco2细胞中添加外源性IAP能够使紧密连接蛋白ZO-1/ZO-2/Occludin的表达水平上调，这种对紧密连接的促进作用能被ERK信号通路抑制剂阻断，而NF-Kb/STAT3/JNK等信号通路抑制剂无明显效果。使用ERK信号通路下游关键因子PKCζ与PP2A的siRNA对IAP基因敲除的Caco2细胞进行干预后，发现PP2A基因受到siRNA缄默后，能有效抑制外源性IAP对ZO蛋白表达的促进作用，而添加PKCζ的siRNA则无明显差异。 结论:IAP是通过ERK-PP2A信号通路来调控肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达，相关机制并不包含NF-kB、STAT3、JNK、WNT等信号通路的作用。