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目的:1.胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤,我国胃癌的发病率逐年上升,且死亡率极高。目前免疫治疗策略在实体瘤的治疗中取得了突破性的成果。其中,PD-1/PD-L1抑制剂是最具有代表性的免疫哨点单克隆抗体药物。有报道指出,一种名为Atezolizumab的PD-L1单克隆抗体药物已经获得美国食品药品监督管理局的批准用于治疗泌尿系统肿瘤。但是到目前为止,还没有有效的免疫治疗方案可以缓解胃癌的继续发展。2.本研究首先基于临床样本,检测患者体内胃癌组织和癌旁组织PD-1/PD-L1的表达情况,并筛选出胃癌患者和正常对照人群中差异性的肠道益生菌菌群。采用PD-L1单克隆抗体和益生菌联合应用的方式,通过细胞实验和体内实验两方面观察对胃癌的治疗效果,并探讨联合应用的作用机制。为提高胃癌的免疫治疗效果、延长胃癌患者的生存期、延缓疾病进展提供了新的思路。方法:1.第一部分:为探讨PD-1/PD-L1在胃癌中的表达情况及对差异性的肠道菌群分析。我们收集筛选了2017年11月至2019年11月期间就诊于锦州医科大学附属第一医院接受了胃癌根治术、并且经病理证实为胃癌的患者80例,并且随机选取20例患者的正常胃组织作为空白对照。收集以上患者粪便,同时收集同年龄段、同时期、同性别的正常体检者粪便。采用IHC法检测胃癌组织和癌旁组织中PD-1、PD-L1和CD8的表达情况。Western-Blot和q RT-PCR检测胃癌和癌旁组织中PD-1、PD-L1的表达水平。同时对胃癌患者进行生存分析。通过细菌培养对胃癌患者和正常体检者的粪便进行差异性菌群的鉴定。应用益生菌干预SGC7901胃癌细胞,分为细胞对照组和益生菌+对照组,采用流式细胞术和Transwell检测两组细胞的凋亡、周期变化和侵袭能力。应用该细胞株进行后续实验。2.第二部分:为观察PD-L1单克隆抗体联合益生菌对胃癌的疗效,我们进行了荷瘤鼠实验。实验分组如下:SGC7901细胞胃癌模型组、益生菌+模型组、PD-L1单抗+模型组和PD-L1单抗+益生菌+模型组,各组小鼠于21天脱颈椎处死小鼠,取肿瘤组织,称重、计算肿瘤体积。采用Western-Blot和q RT-PCR检测各组小鼠肿瘤组织中PD-1/PD-L1的表达情况。3.第三部分:为探讨PD-L1单抗和益生菌联合对胃癌治疗作用的机制,采用第二部分体内实验的分组。应用ELISA法检测各组小鼠血清中Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-β和Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10;趋化因子CXCL9和CXCL4的水平。应用流式细胞检测脾脏CD4+T细胞和CD8+T细胞的水平。采用Western-Blot和q RT-PCR法检测肿瘤组织的CD4、CD8、PD-L1、PD-1表达水平。结果:1.第一部:IHC结果显示,与癌旁组织相比,胃癌细胞膜内高表达PD-1、PD-L1（P<0.05）,胃癌细胞核内高表达CD8（P<0.05）。Western-Blot和q RT-PCR检测发现,胃癌组织表达PD-1、PD-L1的水平明显高于癌旁组织（P<0.05）。生存分析结果表示,肿瘤分期和CD8+T细胞的浸润可作为胃癌术后复发和总生存的独立预后因素;PD-L1表达与CD8+T细胞浸润程度呈正相关（P<0.05）。应用益生菌能够促进胃癌细胞的凋亡（P<0.05）,促进胃癌细胞停留在G2/M期（P<0.05）,降低胃癌细胞的增殖能力（P<0.05）。同时,胃癌患者肠道双歧杆菌的含量明显低于健康对照组（P<0.05）,用于后续实验。2.第二部分:体内实验结果:应用PD-L1单克隆抗体和双歧杆菌联合可抑制胃癌的增长（P<0.05）。Western-Blot和q RT-PCR实验结果显示,PD-L1单克隆抗体和双歧杆菌联合能降低各组小鼠肿瘤组织中的PD-1和PD-L1的表达（P<0.05）。3.第三部分:应用PD-L1单克隆抗体和双歧杆菌联合能够升高荷瘤鼠血清中的IL-2、IFN-γ、TNF-β等Th1型细胞因子（P<0.05）;降低IL-4、IL-6、IL-10等Th2型细胞因子（P<0.05）和CXCL9和CXCL4的含量（P<0.05）。流式细胞术结果显示,应用PD-L1单克隆抗体和双歧杆菌联合能增加小鼠脾脏内CD4+T和CD8+T细胞的含量（P<0.05）。Western-Blot和q RT-PCR实验结果显示,应用PD-L1单克隆抗体和双歧杆菌联合能减轻肿瘤组织的PD-1和PD-L1的表达（P<0.05）,促进CD4和CD8的表达（P<0.05）。结论:本研究发现胃癌患者肠道菌群存在明显差异,益生菌的数量明显少于正常对照组,证明益生菌在胃癌的发生发展中具有重要的作用。本文主要通过PD-L1单抗联合益生菌的方法,通过临床胃癌样本、细胞实验和体内实验等多个角度,发现与单独应用PD-L1单抗或益生菌相比,联合应用PD-L1单抗和益生菌能够降低胃癌组PD-1和PD-L1的表达,抑制胃癌的发展,为临床治疗胃癌提供新的思路,为相关科学研究提供了基础数据支持。