论文部分内容阅读
星形胶质细胞在中枢神经系统中数量最多、分布最广,在形态、受体的分布及胞质活性物质的含量等方面都存在明显的异质性,不同谱系发生的星形胶质细胞在中枢神经系统中所起的作用至今仍不明确。目的:(1)分离、培养获得不同谱系来源的两型星形胶质细胞(T1A和T2A),通过基因表达谱芯片技术构建星形胶质细胞基因表达谱,进行对比分析,筛选出细胞特异性差异表达基因。(2)从获得的基因表达谱中,选定在胶质细胞中新发现的轴突成束和延伸相关基因FEZ1,分析FEZ1在培养的两型星形胶质细胞中的表达定位。(3)分析FEZ1在大鼠脑组织发育过程中的表达变化。(4)通过FEZ1基因克隆,瞬时转染及原核表达方法,初步探讨FEZ1对星形胶质细胞活性及神经元突起生长的影响。方法:第一部分(1)采用振荡法和差速贴壁法,从新生一天SD大鼠大脑皮层分离获得T1A和T2A,免疫荧光双标鉴定;(2)应用BiostarR-40s基因表达谱芯片技术对比分析在培养的T1A和T2A中细胞特异性差异表达基因情况。第二部分(1)利用半定量RT-PCR、Realtime RT-PCR、western blot和细胞免疫化学的方法检测FEZ1基因在T1A和T2A中的表达及细胞定位情况,验证基因表达谱芯片结果。(2)取生后1天、3天、7天、2周、1个月、3个月的SD大鼠,灌注后取脑进行冰冻切片,并分别以FEZ1和GFAP或NF对星形胶质细胞和神经元进行免疫荧光双标,检测FEZ1在脑组织发育过程中的表达定位。第三部分应用RT-PCR方法从大鼠大脑皮层克隆获得FEZ1全长序列,构建pEGFP-N1-FEZ1真核表达重组质粒和FEZ1 RNAi质粒,瞬时转染星形胶质细胞,MTT法检测细胞活力,初步观察FEZ1基因对星形胶质细胞生长的影响;构建pET-28a-FEZ1原核表达重组质粒,体外原核表达His-FEZ1融和蛋白,观察FEZ1对背根节神经元突起生长的影响。结果:(1)应用上海博星基因芯片公司星形胶质细胞基因表达谱芯片BiostarR-40s,四次芯片结果交集显示,在4096个检测点中,发现差异表达基因138条,99个为已知基因,其中42个在T1A中高表达,57个在T2A中高表达。与神经轴突传导相关基因均在T2A中表达上调,其中新发现的与轴突成束和延伸相关的FEZ1基因在胶质细胞中的表达及作用国内外尚未见相关研究报道。(2)RT-PCR及western blot结果显示FEZ1在体外培养的两型星形胶质细胞中mRNA水平及蛋白水平均有表达,且在T2A中表达明显增加,与基因表达谱芯片结果一致。细胞免疫荧光双标结果显示,FEZ1蛋白在O2A祖细胞、T1A、T2A细胞中均有表达,分布于细胞胞浆及突起,在T1A及T2A中可与GFAP共定位,细胞核中没有表达。(3)FEZ1在大鼠脑组织嗅球的僧帽细胞和颗粒细胞,海马齿状回的颗粒细胞,海马CA1-3区的锥体细胞,皮层锥体细胞也有表达,嗅球及海马齿状回星形胶质细胞有表达,生后7天FEZ1表达量达最高。(4)构建的pEGFP-N1-FEZ1真核重组质粒和FEZ1 RNAi质粒经测序鉴定正确,瞬时转染星形胶质细胞,干扰FEZ1基因表达可降低细胞活力,抑制细胞生长。(5)构建的pET-28a-FEZ1原核表达重组质粒经测序鉴定正确,在BL21大肠杆菌中经诱导可表达His-FEZ1融和蛋白,该蛋白对大鼠背根节突起生长有一定促进作用。结论:(1)不同谱系来源的两型星形胶质细胞基因表达谱存在明显差异,其中与神经轴突传导相关基因表达差异提示T1A和T2A可能在诱导轴突生长方面有不同功能。(2)首次研究证实,FEZ1基因在体外培养的星形胶质谱系细胞中均有表达,但在T2A中表达明显增加。(3)FEZ1在大鼠脑组织发育过程中嗅球、海马神经元及星形胶质细胞中有表达。(4)成功构建了pEGFP-N1-FEZ1真核重组质粒、FEZ1 RNAi质粒以及pET-28a-FEZ1原核表达重组质粒,为进一步研究FEZ1对星形胶质细胞生物学特性的影响及在其中枢神经系统中的作用机制等奠定了实验基础。