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β-血红蛋白病是一组多相群的单基因疾病,重型可致死。为了探讨其基因治疗的可行性及潜在价值。本课题拟选择对β-珠蛋白基因具有靶向RNAi的特异序列,并构建慢病毒载体,采用体外筛选法获得目的序列及质粒,以期能与β-珠蛋白等位基因特异性结合抑制RNA的表达,并了解感染细胞的体内植入和增殖情况,以期在以后试验中与其它基因表达载体组合共同用于治疗β-血红蛋白病。内容和方法1.从GeneBank查找HBB mRNA序列,设计挑选3个RNAi靶点,每个合成两条单寡核苷酸链,退火后连入酶切的pGCL-GFP载体,将连接产物转染感受态细菌,对长出的克隆进行PCR鉴定,测序比对。对阳性克隆进行质粒抽提。2.用PCR方法从模板钓取相应的HBB序列片段,将片段与pdsRED2-N1载体进行双酶切后定向连接,转染感受态细菌,长出的克隆进行PCR鉴定,测序和比对分析后,对阳性克隆进行质粒抽提。3.HBB-RNAi-LV质粒和HBB过表达质粒,按低浓度组(0.5:1)和高浓度组(1:1)用Lipofectamine2000共转染293T细胞,48h后FM观察GFP表达,Western Blot检测FLAG-HBB融合蛋白表达。4.将HBB-RNAi-LV质粒和慢病毒包装载体pHelper 1.0及pHelper 2.0载体按4:3:2比例添加,转染293T细胞,培养48小时后收集培养上清,利用Plus-20离心超滤装置对病毒上清进行离心超浓缩。5.人脐血MACS法分离的CD34+细胞,加入细胞因子进行无血清无基质预培养,慢病毒感染,48h后FM观察感染率,Real-Time PCR检测感染2、4、5天的HBBHBG基因表达情况,Western Blot检测感染7天的HBB蛋白表达。6.人脐血CD34+细胞,体外用高浓度细胞因子预刺激培养过夜后感染慢病毒24小时,经皮注射入SCID新生小鼠腹腔,密切观察小鼠存活情况。7.移植后3周,用FM和FCM检测小鼠外周血中人HbF细胞和成人红细胞,外周血有核细胞中的GFP阳性细胞;骨髓细胞中的GFP阳性细胞,并观察小鼠肝、脾、肾脏、小肠等组织中的GFP阳性细胞分布。结果1.构建了3个HBB基因的RNAi-LV载体(PSC1、PSC2、PSC3)及一个对照质粒PSCNC。2.构建了含有相应HBB基因片段的过表达载体HBB- pdsRED2-N1-3Flag质粒。3.外源筛靶试验中PSC1、PSC3对HBB融合蛋白有明显敲减作用,随着浓度增加敲减作用增强,其中PSC1靶点的敲减效果最好。4.包装并获得高滴度的PSC1、PSC3和PSCNC慢病毒。5.慢病毒在CD34+细胞中的感染率为15~30%,病毒感染明显激活细胞中的HBB和HBG基因表达,PSC1促进HBB珠蛋白表达,PSC3则显著抑制HBB和HBG珠蛋白表达,其抑制效果与感染率有关。6.移植CD34+细胞后,小鼠外周血中人HbF细胞及成人红细胞为0.1~1.2%;有核细胞中GFP细胞,PSCNC组为3.2~10.2%, PSC3组为4.4~8.8%;骨髓细胞中GFP细胞PSCNC组为1.5~5.5%, PSC3组为1.3~6.2%,各组间均无统计学意义。肝、脾、肾和小肠等组织均未见明显的GFP阳性细胞。结论1.系统建立了完整的人脐带血CD34+细胞分离、无血清无基质培养和慢病毒感染的实验方法。2.成功构建了3个β-珠蛋白基因shRNA的慢病毒载体,通过外源筛靶方法初筛出2个有效序列,经慢病毒包装获得了高滴度的病毒颗粒。3.成功筛选到一条对HBB基因有抑制作用的RNAi序列。4.人脐血CD34+细胞移植入未骨髓抑制的免疫缺陷病新生小鼠腹腔,可成功归巢、增殖,主要增殖为自身缺陷的淋巴系统,红系缺乏表达优势。