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近年,随着人类基因组序列图完成及分子生物学技术的发展,几乎所有凝血蛋白及血小板膜蛋白等基因已被克隆,这有助于深入了解探索其结构与功能的关系。目前已发现很多遗传性出血性疾病的基因异常,基因诊断是今后遗传性出血性疾病研究的发展方向。遗传性凝血因子Ⅶ缺陷为常染色体隐性出血性疾病,其发病率约为1/500 000,仅次于血友病A、B,而且临床表现迥异。Wiskott-Aldrich综合征是WASP基因突变所致的X连锁隐性遗传病,其临床特征为血小板减少伴小血小板,湿疹及免疫缺陷等。本研究对7例遗传性凝血因子Ⅶ及7例Wiskott-Aldrich综合征的家系成员进行基因诊断并对其致病机制进行研究。本研究分为两部分:第一部分遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症的分子机制研究第一节:7例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者及家系成员的临床与F7基因突变的研究用一期法及ELISA检测PT、凝血因子Ⅶ活性及抗原等凝血指标进行表型诊断;用DNA测序方法对先证者及家系成员F7基因的全部外显子、侧翼区及5′和3′非翻译区进行分析,寻找基因突变位点;应用PCR-RFLP对新发现地突变的先证者及其家系成员相应基因片段进行酶切分析,证实测序所发现地突变;利用长链PCR分析无突变患者的基因组DNA排除大片段缺失;并用剪接分析软件分析剪接位点突变后效应。在7例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者中,PT明显延长,FⅦ活性水平均降低(<5%),FⅦ抗原水平改变不一致,有的明显下降,有的仅轻度降低,其他凝血指标均正常;7例遗传性FⅦ缺陷患者中发现7种基因突变和3种F7基因多态性,其中18094C→T(Gln426X)、16750 C→T(Ser250Phe)(以ProFⅦ的Met为+1位)为国际首次报道,His408Gln,5076-5077 Del CT两种纯合突变为国内首次报道,15975G→A(IVS6-1G→A)、16039 G→A(Arg212Gln),17908 G→A(Arg364Gln)国际均已见报道,IVS6-1G→A突变重复出现于4个无亲缘关系的家系,His408Gln在两个无血缘关系的家庭中。除两例纯合突变外,其余均为双重杂合性突变;1例新的基因多态性10081 C→T,其杂合率为4%。其中5076-5077 Del CT纯合子、Gln426X与IVS6-1G→A双杂合子患者临床出血表现较重;Ser250Phe与IVS6-1G→A、His408Gln与Arg212Gln双杂合子患者出血症状较轻;His408Gln纯合子、Arg364Gln与IVS6-1G→A双杂合子及仅发现IVS6-1G→A突变的患者及家系成员无明显临床出血表现。从上述结果可得出以下结论,7例遗传性FⅦ缺陷患者中发现了7种基因突变,其中2种突变为国际首次报道;IVS6-1G→A可能为中国汉族人的热点突变;但F7基因突变、FⅦ活性及抗原水平及临床表现无明显相关性。第二节新的错义突变Ser250Phe致遗传性凝血因子Ⅶ缺陷的分子机制Ser250Phe发生于FⅦ的丝氨酸蛋白酶活性中心附近,影响蛋白构象,使其活性及分泌合成受到影响。利用正常肝组织提取的mRNA构建正常(野生)FⅦcDNA真核表达载体(pcDNA3.1),在此基础上利用PCR介导的质粒定点诱变技术,用一对反向互补的突变引物PCR扩增后,Dpn I消化模板,然后转化到感受态细胞(DH5α)中修复。用脂质体法(Lipofectamine 2000)分别转染HEK293和CHO细胞,通过体外表达FⅦ活性及抗原的测定、Western Blotting分析、高尔基/内质网定位的质粒及免疫荧光技术及分子模型分析等方法研究Ser250Phe致遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症的分子机制。研究结果显示突变体Ser250Phe转染细胞后,在细胞裂解液中能检测到与野生型一致的FⅦ抗原量,但细胞培养上清中仅有极微量的FⅦ活性及抗原;亚细胞定位分析中,突变体能与内质网及高尔体共定位;分子模型分析示Ser250被较大侧链疏水的Phe替代后,改变了氢键位置并增大空间位阻,可能破坏了FⅦ的空间构象。从上述研究结果可推出以下结论:Ser250Phe突变体构象改变,在细胞内能正常合成,而且能从内质网转运至高尔基体,但分泌障碍而导致FⅦ的表达降低。第二部分7例Wiskott-Aldrich综合征的临床特点和基因分析用流式细胞术、免疫比浊法及血细胞分析仪分别检测各患者细胞免疫功能、体液免疫功能及血小板计数及平均血小板体积;用DNA测序方法分析各患者WASP基因的外显子、侧翼区与3′与5′非翻译区,寻找基因突变,并与人类基因突变数据库比较。7例Wiskott-Aldrich综合征患者均有皮肤粘膜的出血表现,反复感染高热,湿疹及反复腹泻,均无自身免疫疾病及肿瘤,临床评分为3或4分;骨髓检查均提示免疫性血小板减少性骨髓象;血小板均减少伴体积偏小,均有贫血且提示小细胞低色素性贫血,白细胞偏高;绝大部分患者(6/7例)的CD3+细胞减少,CD4+/CD8+比值紊乱,B细胞及NK细胞的比例正常;绝大部分患者(6/7例)的IgG升高,而IgA全部升高。在7例Wiskott-Aldrich综合征患者中发现了6种基因突变,除6783 C→G(Tyr102stop)突变发生于外显子3;另外5种突变均发生在外显子10, 10250C→T (Gln440stop),10216-10221 Ins G与9964 Del T均导致框移,分别于aa494及aa440处提前终止,10192-10203 Del GCCTGCCGGGG,10052-10059 Del GCTACTG均为小片段的缺失致框移;前三种突变患者母亲均为携带者,后二者母亲均为正常人,属于散发的病例;有一例患者虽然有WAS的临床表现,但现行的方法未能找到突变位点。从上述结果可以看出,Wiskott-Aldrich综合征患者的血小板均减少且伴体积减小,但免疫功能及骨髓象改变变化较大,不具有诊断及预后价值;在基因检测中,发现了5例国际首次报道的突变,而且有两例散发的病例,这些突变均为无义及小插入或缺失突变。这些基因突变类型及位点与临床表现有一定的关系。