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研究背景和目的: 近期研究指出血管内皮功能障碍(Endothelial dysfunction, ED)是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)发生和加重的重要基础或起始事件,也是糖尿病血管病变发生的主要原因,假性血友病因子(vonWillebrand factor, vWF)、内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)是检测 ED的两个重要指标。内皮细胞功能障碍主要特征之一表现为内皮细胞异常凋亡。细胞凋亡(apoptosis),亦称为程序化的细胞死亡(Programmed cell death,PCD),是一种不同于细胞坏死的生理性或者病理性的死亡过程。研究证实,在高糖对血管内皮细胞损伤过程中细胞凋亡起着重要的作用,因此,防治高糖诱导的内皮细胞凋亡在预防糖尿病血管并发症的发生、发展有着重要意义。2型糖尿病(diabetes mellitus type2,T2DM)血管内皮功能紊乱与蛋白激酶B(Protein Kinase B,PKB/Akt)活性受到抑制有关。Akt是体内重要的凋亡抑制蛋白,介导了肿瘤、糖尿病等多种疾病的病理过程,通过Thr308和Ser473位点磷酸化使Akt激活,进而磷酸化底物调节细胞凋亡和细胞代谢。 实验证明,NO-1886具有很强的活化脂蛋白脂酶的作用,它能够提高动物脂肪、心肌和骨骼肌组织中 LPLmRNA的表达和LPL活性,可提高血浆 LPL活性30~40%,降低血糖、血浆三酰甘油,升高高密度脂蛋白胆固醇水平;促进脂质氧化,能抑制脂质蓄积,减轻胰岛素抵抗,降低血浆葡萄糖浓度,抑制糖尿病实验动物动脉粥样硬化病变。本研究通过体外培养高糖诱导的人脐静脉内皮细胞这个平台,从细胞和分子水平,观察NO-1886对高糖诱导的内皮细胞功能障碍是否有保护作用,研究高糖环境下NO-1886对内皮细胞损伤的作用是否与内皮细胞凋亡有关,并探讨NO-1886抗凋亡的分子机制。 方法: 体外培养,利用高浓度葡萄糖诱导人脐静脉内皮细胞功能损伤。用普通光镜和Hoechst33258荧光染色观察HUVECs细胞形态和核形态的变化;Annexin V和PI双染的流式细胞术进行细胞凋亡定量;用荧光定量逆转录-聚合酶链式反应检测细胞内Akt、ET-1、vWF mRNA的表达;细胞免疫荧光检测细胞内ET-1、vWF蛋白水平的改变;用Western blotting免疫印迹实验检测Akt总蛋白表达及Akt-Thr308及Akt-Ser473的磷酸化水平。 结果: (1)与对照组细胞比较,用不同浓度高糖处理HUVECs细胞72小时后,普通光学显微镜下观察到,细胞数目减少,圆形细胞明显增多,细胞间隙增宽,细胞边界不清;Hoechst33258染色结果表明有细胞核浓缩、呈高亮度蓝色荧光的凋亡细胞;流式细胞术检测结果表明细胞凋亡率显著增加;细胞 ET-1、vWF mRNA及蛋白表达上调;Akt磷酸化水平下降。(2)不同浓度的NO-1886对体外高糖环境下内皮细胞凋亡和Akt的活性及ET-1、vWF的表达有着不同的影响:低浓度(2,4,8μmol/L)NO-1886短时间(6,12,24,48h)处理可抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡,增加Akt的活性,显著降低ET-1、vWF mRNA及蛋白表达;而高浓度(32mol/L) NO-1886及长时间(72h)处理则进一步降低Akt的活性,加重高糖的细胞毒性作用。(3)PI3K阻断剂LY294002可抑制NO-1886的抗凋亡作用,减弱NO-1886对Akt的磷酸化。(4)NO-1886对Akt mRNA及其总蛋白表达的影响无统计学意义。 结论: 1.脂蛋白脂酶活化剂NO-1886通过抑制人脐静脉内皮细胞ET-1、vWF的表达起到保护内皮细胞的作用。 2.NO-1886激活信号分子 Akt,显著抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡可能是其心血管保护作用的机制之一。