戊型肝炎病毒(HEV)是通过粪-口途径传播的非甲非乙型肝炎的一个主要病因，在亚洲、非洲和拉丁美洲的一些发展中国家呈流行或散发流行，近期研究发现戊型肝炎散发发病率呈上升趋势。目前在中国戊型肝炎的发病率大约为10％-20％，其中大部分病例为青少年和成人，也有小部分为儿童和老人。尽管戊型肝炎引起的总体死亡率很低，但孕妇感染HEV后其死亡率可达20％。武汉地区，近年来戊型肝炎散发发病呈上升趋势，而目前临床上主要通过检测抗HEV-IgM和抗HEV-IgG来作为诊断指标。许多HEV抗原，包括合成肽、ORF3重组蛋白和大多数ORF2重组蛋白，对急性期血清有较好的活性，但对恢复期血清的反应性则较弱或结果不易判断。若用于血清流行病学研究会明显低估感染率，在临床诊断中无法判断既往感染与近期感染。虽然用于检测的抗原片断不断更新，检测方法多种多样，目前市场提供的抗HEV-IgM检测试剂盒仍由于灵敏度太低而无法满足临床诊断需要。因此，可靠的抗戊型肝炎病毒IgM以及IgG诊断试剂的研制，建立新的诊断方法是一个急待解决的问题。来自世界不同地区的戊型肝炎病毒核苷酸序列不完全相同，根据戊型肝炎病毒核苷酸序列的同源性75％以上定义为同一个基因型，可将全球分离的HEV分为8个基因型，至少24个基因亚型。同一个体感染的戊型肝炎病毒核苷酸序列也不完全相同，其差异大约在2-15％，不超出病毒不同的基因型或亚型，称为准种。戊型肝炎病毒的异质性和临床特征对于理解其致病特点、建立特异性的珍断试剂盒以及制备相应的疫苗具有重要意义。HEV基因序列有3个部分重叠的开放读码框(ORF)，ORF1主要编码与病毒RNA复制有关的非结构蛋白，ORF2为HEV的主要的结构基因编码区，编码衣壳蛋白，ORF3仅有369个核苷酸，与ORF1有1nt重叠，与ORF2有328nt重叠，产物含123个氨基酸，分子量为13.5kD。编码的产物与HEV的特异性免疫反应、病毒组装有关，参与调节MAPK细胞信号传导过程，与肿瘤激活基因101相互作用，ORF3的功能特点类似慢性肝炎的过程，其功能亦不明了。为此，本课题对在武汉同济医院住院及门诊就诊的戊型肝炎病人进行了流行病学调查及基因分型，建立了用免疫吸附测定法(ELISA)检测病人血清中的抗-HEV IgA的方法，显示其在戊型肝炎诊断中的必要性。同时我们成功地构建了重组pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3融合蛋白的真核表达载体，并且在HepG2细胞系上获得了稳定表达，最后我们探讨了他们对HepG2细胞系增殖和凋亡的影响，为进一步研究ORF3功能奠定了基础。目的1．研究武汉地区戊型肝炎病毒(HEV)流行病学特点及基因分型，了解我国戊型肝炎病毒异质性分布特点，寻求基因型别与疾病临床转归的关系。2．建立酶联免疫吸附检测血清抗HEV-IgA的方法，试图提高HEV诊断的敏感性、特异性。3．研究HEV开放读码框架3(ORF3)基因序列的准种特点，从基因水平寻找ORF3功能的基础。4．构建表达戊型肝炎病毒(HEV)pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3融合蛋白的真核表达载体；获得重组质粒稳定转染的HepG2细胞系，为HEV ORF3功能的研究作前期准备。5．初步研究pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3融合蛋白对HepG2细胞的增殖和凋亡作用。方法1．收集从2003年8月-2004年8月同济医院就诊的急性戊型肝炎患者916例，应用逆转录-套式聚合酶链反应法(RT-nested-PCR)，扩增HEV开放读码框架2(ORF2)的部分序列120份，选取其中25份进行测序，结果用Clustal X和Treeview软件比较武汉地区HEV序列与4个HEV主要代表株序列。2．应用北京万泰公司商品化基因重组HEV ORF-2／ORF-3抗原预包被的酶标板，HRP标记羊抗人IgA建立检测血清抗HEV-IgA的方法。酶联免疫试验检测60例HEV RNA阳性戊型肝炎患者不同时间段血清抗HEV-IgA、抗HEV-IgM(捕获法)、抗HEV-IgG水平。3．在经测序证实HEV血样本中，挑选2份标本，扩增其中HEV开放读码框架3(ORF3)的全部序列，克隆入pMD18-T Vector，其中1例挑选30个克隆进行测序。4．利用PCR技术从HEV基因组中扩增出ORF3基因片断，EcolⅠ／BamHⅠ双酶切后分别连接到经同样酶切的pEGFP-N2和pXF2RH真核表达载体，转化DH5α菌株感受态细胞，获得阳性重组质粒pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3。将阳性克隆用脂质体法转染HepG2细胞，G418筛选抗性克隆，在荧光显微镜下观察pEGFP-ORF3增强型绿荧光蛋白表达，SDS-PAGE、Western blot分析鉴定pXF2RH-ORF3融合蛋白的表达。5．用MTT比色法测定细胞增殖情况，流式细胞仪碘化丙啶染色法检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果1．25例散发性戊型肝炎病毒，核苷酸同源性在82.61-98.55％，与Ⅰ型(缅甸株)、Ⅱ型(墨西哥株)、Ⅲ型(美国株)、Ⅳ型(中国／台湾株)核苷酸同源性分别为76.52-81.74％、70.43-73.04％、76.52-81.16％和84.35-88.70％。系统进化树显示它们至少可分为三个亚型。2．60例戊型肝炎患者血清抗HEV-IgA、抗HEV-IgM全部阳性。410例非戊型肝炎病人中，6例抗HEV-IgA阳性，7例抗HEV-IgM，除1例抗HEV-IgA、抗HEV-IgM同时阳性外(隐性感染)，其余均为单阳性，抗HEV-IgG和HEV RNA阴性。动态检测戊型肝炎患者血清HEV RNA、抗HEV-IgA、抗HEV-IgM和抗HEV-IgG，发现急性戊型肝炎血清HEV RNA持续阳性至病后2月(20±11d)，抗HEV-IgA、抗HEV-IgM阳性持续整个观察期，半数阳性率分别持续3个月和4个月，从病后第2个月起，抗HEV-IgA、抗HEV-IgM阳性率在同月相比，差异有显著意义。3．2例ORF3区全基因组碱基序列同源性为90.43％～93.62％，来源于同一患者ORF3区全基因组不同克隆之间的碱基序列同源性为97.97％～99.71％，与Ⅳ型(中国／台湾株)核苷酸同源性为89.86％～99.71％。ORF3区可检出点突变、缺失突变、短序列的插入突变。4．真核表达载体转染HepG2细胞，经持续G418压力筛选和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系，细胞内表达增强型绿荧光蛋白，SDS-PAGE在28.5kD左右蛋白表达量明显高于对照组，Western blot在28.5kD左右有一条强的棕色条带，说明pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3在HepG2细胞中得到表达。5．pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3转染组的HepG2细胞的增殖速度比未转染组和空载体转染组细胞轻度升高，差异无统计学意义(P＞0.05)。转染的肿瘤细胞株HepG2的细胞周期分布是G1=68.09％和67.1％，S=19.50％和19.0％，G2=12.41％和13.9％，凋亡率为0.83％和0.86％；未转染HepG2细胞周期分布是G1=72.15％，S=14.91％，G2=12.95％，凋亡率为1.41％，差异无统计学意义。流式细胞仪检测细胞凋亡峰不明显。结论1．武汉地区散发性戊型肝炎患者以HEVⅣ型感染为主。散发性戊型肝炎发病率呈上升趋势，发病年龄以30岁至59岁为主，男∶女之比约为3.3∶1，全年均可发病，3-6月为高峰季节。2．成功建立检测血清抗HEV-IgA的方法，戊型肝炎患者抗HEV-IgA阳性率较抗HEV-IgM阳性率特异性强、持续时间长。联合HEV-IgM和抗HEV-IgA检测，可提高急性戊型肝炎诊断的敏感性。3．多个克隆测序结果提示患者体内HEV呈现准种群共存，HEV-ORF3 C末端2个富含脯氨酸区多有点突变，点突变不影响脯氨酸表达。4．在HepG2细胞中高表达pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3融合蛋白，可获得大量融合蛋白。5．转染pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3融合蛋白的真核表达载体对HepG2细胞增殖速度与细胞凋亡无明显影响。本研究的创新点1．首次研究武汉地区戊型肝炎病毒(HEV)流行病学特点、基因分型和HEV开放读码框架3(ORF3)基因序列的准种特点。2．初步建立了酶联免疫吸附检测血清抗HEV-IgA的方法。3．首次在HepG2细胞表达HEV开放读码框架3(ORF3)基因编码融合蛋白，该蛋白没有引起HepG2细胞明显的凋亡，是否对细胞有增殖作用有待进一步研究。研究意义1．HEV病毒基因分型的研究可以加强对病毒起源及进化的认识；有助于分析戊型肝炎在全球范围内的地理分布特征，更好地了解HEV变异性和流行病学特征；了解其基因异质性与抗原异质性之间的关系，可以考虑建立不同基因型HEV感染的检测方法，提高检测特异性，进而避免因抗体特异性减弱或降低而导致的误诊。总之对病毒的临床治疗和预防都有着重要的意义。2．戊型肝炎病毒(HEV)感染的诊断主要依赖于可靠的检测方法，目前临床常检测抗-HEV IgG及IgM。抗-HEV IgG出现早，检出率高，但持续时间长，发病后6～12个月大部分患者抗-HEV IgG仍然阳性，因此无法区分是急性戊型肝炎还是既往HEV感染。抗-HEV IgM出现早，发病三个月以后基本转阴，是急性戊型肝炎的特异指标，但检测的灵敏度不高(60％～70％)。因而在戊型肝炎诊断中有一定的局限性，抗HEV-IgA可作为戊型肝炎近期感染的辅助抗体，同时检测抗-HEV IgA，可提高诊断率和检测敏感性，还协助假阳性的判断，有利于正确诊断。3．戊型肝炎病毒感染，临床症状显著者多是15-30岁年轻人，死亡率0.5-3.0％，孕妇死亡率高达20％。其发病机制可能有病毒直接损伤肝细胞和免疫损伤参与，详细机制不明。ORF3是胞外信号调节激酶(ERK)和应激活化蛋白激酶／C-Jun N端激酶等MAPK超家族激酶的底物，可能参与细胞的生长、凋亡过程。ORF3功能的研究有利于进一步了解HEV致病机制及确定治疗方案。