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自20世纪末以来,H9N2亚型禽流感病毒（AIV）已成为中国家禽中流行最广的禽流感病毒亚型。虽然该亚型AIV致病性较低,但其易与其他病原体发生混合感染,导致家禽产蛋率降低甚至死亡,对养殖业造成了严重经济损失。尽管在我国对家禽的疫苗接种未曾间断,但H9N2亚型AIV仍持续在鸡群中传播。因此,需要研发新型的H9N2亚型禽流感疫苗以降低其对养殖业的损失以及公共卫生安全的威胁。本研究建立了新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）疫苗株Mukteswar株（简称M株）的反向遗传操作系统,以此为基础构建了表达H9亚型AIV HA马赛克序列（H9M）的重组病毒r M-H9M以及表达H9亚型AIV HA马赛克序列（H9M）和三个M2蛋白胞外域串联体（3M2e）的重组病毒r M-H9M-3M2e,并对其生物学特性和免疫原性进行研究,研制出一种新型H9亚型禽流感-新城疫二联活载体疫苗,为H9亚型禽流感与新城疫的防控提供技术支持。1.M株反向遗传学操作系统的建立本实验以NDV基因III型疫苗株Mukteswar基因组为模板,设计9对引物,通过RT-PCR扩增获得全基因组的9个小片段,通过重叠PCR将其融合成3个中等片段H1、H2、H3,然后以In-fusion无缝连接的方式将三个中等片段依次连接到载体p ACNR-T7上,获得重组质粒p AC-Mukteswar（p T7-M）。将其与三个辅助质粒共转染至预先感染了痘病毒的BHK-21细胞,进行病毒拯救获得r T7-M重组病毒。结果表明,成功获得了NDV M株全长c DNA感染性克隆p T7-M,并获得了重组病毒r T7-M,且生物学特性与疫苗株M相似,表明成功建立了M株的反向遗传操作系统。2.重组病毒r M-H9M、r M-H9M-3M2e的构建与拯救将H9N2亚型AIV的HA蛋白马赛克序列（H9M）插入至NDV r T7-M株载体的P和M基因之间,获得重组病毒r M-H9M。同时将3M2e与r M-H9M的HN蛋白C端融合,构建r M-H9M-3M2e重组病毒。间接免疫荧光（IFA）及免疫印迹（Western-blot）实验结果表明两株重组病毒均能够稳定表达外源蛋白。生物学特性检测结果显示重组病毒r M-H9M、r M-H9M-3M2e与亲本株M具有类似的增殖特性。重组病毒r M-H9M、r M-H9M-3M2e的最小鸡胚致死剂量的平均致死时间（MDT）分别为64 h、68 h;1日龄SPF雏鸡的脑内致病指数（ICPI）分别为1.50、1.41,与M株相比略微下降。结果表明,成功构建了两株重组病毒r M-H9M、r M-H9M-3M2e,二者与亲本株具有相似的生物学特性,且外源基因的插入略微降低了重组病毒的毒力。3.重组病毒r M-H9M、r M-H9M-3M2e的免疫原性评价为了评价重组病毒r M-H9M、r M-H9M-3M2e的免疫原性,将重组病毒r M-H9M、r M-H9M-3M2e分别以滴鼻点眼的方式免疫4周龄的SPF鸡,免疫剂量为10~6EID50/只。免疫14 d后,对两组实验鸡的抗体水平进行了检测。NDV HI抗体水平均在临界保护值4log2以上,AIV HI抗体水平超过7log2。免疫14 d后分别用两株H9N2异源毒株（DY0602、JM0305）进行攻毒试验,攻毒后第3 d、5 d、7 d采集喉拭子和泄殖腔拭子,检测试验鸡的排毒情况。结果显示,第5天各组的阳性率差异最大,DY0602株攻毒组,r M-H9M和r M-H9M-3M2e免疫组喉拭子的阳性率为40%和80%,泄殖腔拭子的阳性率均为0%;而PBS组喉拭子的阳性率为100%,泄殖腔拭子的阳性率为70%。JM0305株攻毒组,两组免疫组r M-H9M和r M-H9M-3M2e的喉拭子的阳性率分别为50%、40%,而PBS组喉拭子的阳性率为100%。以上结果表明重组病毒均能够有效降低实验鸡的排毒。同时阳性拭子的病毒滴度测定结果显示,在第3 d时,各免疫组阳性拭子的病毒滴度明显低于PBS组,在JM0305株攻毒组中,r M-H9M免疫组及r M-H9M-3M2e免疫组阳性喉拭子的病毒滴度分别为103.25EID50/0.1m L、103.5EID50/0.1m L,而PBS组的病毒滴度(106.25EID50/0.1m L)分别是免疫组病毒滴度的1000倍、562.3倍。所以,重组病毒r M-H9M和r M-H9M-3M2e均可以诱导SPF鸡产生高水平的新城疫和H9亚型禽流感抗体,且能够明显降低排毒水平。综上所述,本研究成功建立了NDV疫苗株Mukteswar（M）的反向遗传操作系统平台,并以此为基础构建了两株重组病毒r M-H9M和r M-H9M-3M2e,免疫SPF鸡后可诱导机体产生较高水平的新城疫和H9亚型禽流感抗体,同时能有效抑制AIV的排毒,并且对异源H9N2亚型AIV具有一定的交叉保护作用,可以作为防控H9亚型禽流感和新城疫的候选活疫苗。