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短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila),隶属茜草科(Rubiaceae)蛇根草属(Ophiorrhiza),是一种多年生双子叶草本植物,全草含抗癌药物喜树碱(CPT)及其衍生物。喜树碱衍生类药物目前广泛应用于癌症临床治疗,但药源的短缺成为研发和应用喜树碱类化合物的巨大瓶颈。而植物次生代谢工程的发展为解决药源短缺,提高药用成分含量提供了一个很好的解决方案。本研究通过采用短小蛇根草转录组测序和基因工程手段,挖掘了参与调控喜树碱生物合成的相关基因,初步研究了其功能,并获得了高产喜树碱的转基因材料。1、根据与拟南芥基因序列比对注释,选择可能参与次生代谢合成调控的16条全长bHLH转录因子,进行后续分析。通过基因克隆、结构域以及功能预测、组织表达谱等,最终选择OpMYC2L1和OpMYC2L2这两条转录因子进行了功能研究。2、为了确认OpMYC2L1和OpMYC2L2在喜树碱合成途径中的作用,分别构建了OpMYC2L1和OpMYC2L2的过表达和抑制表达载体,在短小蛇根草体内进行了功能验证。通过转基因毛状根株系喜树碱含量测定发现,在过表达的株系中,喜树碱的含量都上调了2倍以上,裂环马钱子苷有所下降,但下降不显著。3、利用酵母单杂交系统,分析了OpMYC2L1和OpMYC2L2对喜树碱合成途径中的TDC、CPR、G10H、SLS基因的调控作用,研究结果表明OpMYC2L1和OpMYC2L2能够与关键酶SLS启动子中的G-box结合。因此,推测Op MYC2L1和OpMYC2L2可能参与关键酶SLS的表达调控。4、为了分析OpMYC2L1和Op MYC2L2在甲基茉莉酸途径中的作用,利用酵母双杂和Bi Fc系统,研究了这两条转录因子和上游JAZ之间的相互作用。酵母双杂研究结果显示JAZ1、JAZ2、JAZ3、JAZ4、JAZ5能够和OpMYC2L1相互作用,而JAZ1、JAZ2能和OpMYC2L2相互作用。而BiFc实验也验证了JAZs能和OpMYC2L1和OpMYC2L2发生作用。因此推测OpMYC2L1和OpMYC2L2和JAZ存在相互作用,可能共同参与对外源甲基茉莉酸诱导的响应,并影响喜树碱合成下游SLS基因的表达。本论文研究了OpMYC2L1和OpMYC2L2两条基因的功能,为建立喜树碱的合成调控网络,提供了一定的理论依据和技术支持。