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CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated)系统广泛分布于古菌和细菌中,是一种抵御病毒和质粒等外源遗传物质的获得性免疫系统。在最新的分类中,CRISPR-Cas系统已被分为两大类和六个亚型,其中主要的三个亚型(I型,II型和Ⅲ型)得到了广泛的研究。II型CRISPR/Cas9系统目前已被广泛应用于不同的细菌和真核生物的基因组编辑;此外,I型和II型CRISPR-Cas系统还被开发成抗菌剂来选择性消除特定的菌群。但是,迄今还没有利用I型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统进行基因组编辑的报道。本研究在冰岛硫化叶菌中开发了一种基于其内源的I型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法。该方法只需要构建一个新型的基因组编辑质粒(pGE),该质粒携带一个提供能靶向干涉或沉默基因的成熟CRISPR RNA的人工mini-CRISPR簇以及一个含有非靶标序列的用于同源重组的供体DNA片段。将pGE质粒转化到宿主细胞之后,细胞将会有两种命运:野生型细胞因基因组DNA被靶向降解而死亡;而那些基因组与供体DNA发生了同源重组从而携带突变基因的细胞能免于干涉而成为转化子存活下来。利用该方法,本研究实现了不同类型的基因组编辑,包括缺失、插入和定点突变。我们相信该方法可以推广到其它含有能干涉DNA的CRISPR-Cas系统的细菌和古菌。研究不同CRISPR-Cas系统的分子机制是应用开发的基础,且已成为当前生物学研究的热门领域之一。已有研究表明,Ⅲ型CRISPR-Cas系统与其它类型有显著不同的核酸干涉活性,其既有RNA酶活性也有RNA激活的DNA酶活性。我们的前期研究已经揭示了冰岛硫化叶菌Ⅲ-B型Cmr-α系统在体内同时具有RNA干涉活性和依赖于转录的DNA干涉活性。为了更深入的解析相关机制,本研究用一个携带43 nt SS1spacer(靶向lacS基因上protospacer SS1)的人工mini-CRISPR质粒,从冰岛硫化叶菌中纯化出天然Cmr-α复合物,并对其进行了系统的体外研究。研究发现,Cmr-α复合物能切割与复合物中的crRNA互补配对的靶标RNA,同时该靶标RNA又能激活Cmr-α复合物的ssDNA切割活性,该活性需要靶标RNA的3’端侧翼序列与crRNA的5’端tag序列错配。此外,激活的Cmr-α复合物能够快速切割大量的ssDNA底物,这说明Cmr-α系统可以快速消灭复制中的病毒DNA。为了揭示Cmr2α蛋白在Cmr-α系统DNA干涉活性中的功能,本研究针对Cmr2α的HD和Palm两个结构域构建了四个突变株,分别命名为HD-M1(H14N和D15N),HD-M2(H14N,D15N,K19A和I23A),Palm-M1(G666K和D667K)和Palm-M2(662-IYlGGDDi LA-671—AAlAAAAiAS)。体内干涉质粒分析显示,其中3个多氨基酸突变株HD-M2、Palm-M1和Palm-M2都丧失了DNA干涉活性。而HD结构域的双氨基酸突变株HD-M1却只是消除了体外的DNA切割活性。这些结果表明,Cmr2α的HD和Palm两个结构域都是Cmr-α系统体内DNA干涉所必需的,而体外检测到的ssDNA切割活性可能只是HD结构域介导的。此外,Ⅲ型CRISPR-Cas系统的crRNA加工成熟和靶标核酸的结合机制仍然是不清楚的。本研究用携带不同长度spacer(14,20,28,40和76 nt)的人工mini-CRISPR质粒分别纯化Cmr-α复合物。结果显示,无论spacer长短,Cmr-α系统都合成固定长度的crRNA(40 nt和46 nt)。这说明mini-CRISPR簇下游的repeat元件可以在没有被加工情况下补充为crRNA序列。此外,一个仅含有上游repeat元件和40 nt spacer的人工mini-CRISPR质粒也能合成一样固定长度的crRNA。这些结果表明,Cmr-α复合物的组装可能是从crRNA的5’端tag区域(经Cas6初加工产生)起始,而crRNA的3’端则由其它未知的RNase加工成熟,从而组装成两个固定大小的复合物。另外,对这些复合物的体外切割活性和结合靶标RNA能力的分析表明,随着复合物中crRNA的3’端区域和靶标RNA的5’端序列错配碱基数的增加,不能被复合物结合和切割的RNA底物的数量也随之增加。在Ⅲ-B型效应复合物的结构模型中,结合cr RNA的3’端区域的是Cmr1亚基。本研究在冰岛硫化叶菌中构建了一个Cmr1α缺失突变株和两个关于Cmr1α的丙氨酸替换突变株,分别命名为ΔβΔ1α,Δβ1α-M1(W58A和F59A),Δβ1α-M2(I52A,G54A,R57A和R61A)。体内基于mini-CRISPR的报告基因法分析表明,Δβ1α-M1的RNA干涉活性相比野生型菌株大大降低,而ΔβΔ1α和Δβ1α-M2则基本丧失了RNA干涉活性。纯化Cmr1α三个突变株的Cmr-α复合物发现,突变株Δβ1α-M1 Cmr-α复合物的组分和野生型基本一样,而突变株Δβ1α-M2 Cmr-α复合物的组分却和ΔβΔ1α一样,都缺少Cmr1α蛋白。同时,体外RNA切割实验与体内的RNA干涉活性分析结果一致。在靶标RNA激活的DNA切割活性分析中,突变株ΔβΔ1α和Δβ1α-M2的复合物均基本丧失了DNA切割活性,突变株Δβ1α-M1的Cmr-α复合物也只检测到相比野生型复合物非常弱的DNA切割活性。此外,EMSA实验结果显示,ΔβΔ1α和Δβ1α-M1的Cmr-α复合物均很难与靶标RNA形成三元复合物(Cmr蛋白,crRNA和靶标RNA)。以上结果表明,Cmr1α在Cmr-α复合物与靶标RNA形成三元复合物过程中扮演关键角色。两个保守的疏水氨基酸(W58和F59)是Cmr-α复合物结合靶标RNA所必需的,另外四个氨基酸(I52,G54,R57和R61)可能主要介导Cmr1α与crRNA相互作用,从而形成完整的Cmr-α复合物。