实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化(MS)的动物模型,是由Th1和Th17细胞介导的一种中枢神经系统自身免疫性炎性脱髓鞘疾病动物模型。在中枢神经系统,渗入的自身活化的Th1/Th17(CD4+T)细胞,CD8+T细胞,巨噬细胞/树突状细胞,肥大细胞以及活化的小胶质细胞,会产生大量的促炎性细胞因子IFN-γ,IL-17,TNF-α,GM-CSF和IL-23等,促进细胞介导的免疫反应。尽管发病机理尚不完全清楚,但针对其炎性反应的特点,目前临床上多发硬化的治疗多以抗炎和免疫调节为主。IFN-β作为临床上第一个批准的免疫调节药物,对于MS的治疗发挥了重要作用。但是,迄今为止,内源性的IFN-β的来源以及其具体的作用靶细胞仍不是十分清楚。中枢神经系统的炎症微环境、炎症调节以及中枢神经系统细胞对炎症反应的响应程度对于MS/EAE的疾病进展具有重要作用。因此,探索中枢神经系统病灶组织在神经免疫和炎症情况下的反应对于阐明MS/EAE的发病机制并发现新的治疗靶点具有重要意义。在前期的研究中,基于mi RNA多靶点性的特点以及其在众多疾病和生理过程中的重要作用,我们聚焦于EAE疾病中病灶部位mi RNA的表达变化,并以此为基础着重从表观遗传学的角度探讨CNS特异性mi RNA在MS/EAE炎性脱髓鞘和影响髓鞘再生中的作用和机制。取得的研究结果如下:(1)利用200μg MOG35-55免疫8-12周雌性C57BL/6小鼠,发病高峰期(免疫后20天),麻醉后PBS充分灌注小鼠,取EAE小鼠和同龄同性别小鼠脊髓腰膨大段提取总RNA,反转录后用SABiosciences公司的小鼠mi RNA PCR array芯片检测EAE小鼠脊髓病灶部位mi RNA的表达差异,发现EAE小鼠病灶部位mi R-146a、mi R-147、mi R-155、mi R-223、mi R-509-3p的表达显著上调,mi R-124,mi R-132,mi R-338的表达显著下调。选取表达显著上调mi R-146a分子为研究对象,利用RNA原位杂交技术对其表达进行验证,发现EAE小鼠病灶部位的mi R-146a相较于对照组显著升高。进一步分离纯化并体外培养小鼠的原代星形胶质细胞和小胶质细胞,利用IL-17,TNF-α以及IL-17结合TNF-α等炎症因子处理,发现炎症刺激会显著升高两种细胞内mi R-146a的表达,并且IL-17和TNF-α具有协同作用效果。(2)构建带有mi R-146a sponge的用以抑制mi R-146a的表达慢病毒载体,将其命名为mi R-146a inhibitor,包装慢病毒并进行滴度测定。用PBS将病毒稀释成5×108IU/ml。利用200μg MOG35-55免疫8-12周雌性C57BL/6小鼠,发病初期(免疫后第14d)和高峰期(免疫后第20d)利用侧脑室注射的方式分别给予20μl/mouse慢病毒LV-mi R-146a inhibitor或对照慢病毒,统计小鼠临床神经功能评分,发现EAE中中枢抑制mi R-146a的表达可以显著缓解病情。而抑制中枢mi R-146a的表达对外周免疫细胞的比例、数量、增殖、炎症因子的分泌并无影响。免疫组化结果显示抑制中枢mi R-146a的表达减少了中枢炎性浸润和脱髓鞘的变化。同时免疫荧光化学结果显示,抑制中枢mi R-146a的表达显著减少了中枢神经系统白细胞、单核吞噬细胞和中性粒细胞的数量,也缓解了病灶部位的星形胶质细胞化。(3)检测EAE发病不同阶段中枢神经系统病灶部位mi R-146a及相关基因的表达,发现mi R-146a在病灶部位的表达与TRAF6及IFN-β的表达显著负相关。进一步利用生物信息学分析发现,TRAF6基因3’非编码区含有两个mi R-146a结合位点(447-468,506-532),体外培养的星形胶质细胞中,转染mi R-146a会显著抑制TRAF6的表达。利用携带TRAF6 3’非编码区或mi R-146a结合位点突变的TRAF6 3’非编码区双荧光素酶报告基因系统转染原代星形胶质细胞发现TRAF6是mi R-146a的直接作用靶点。进一步利用EAE动物模型发现,中枢特异性抑制mi R-146a表达的同时下调TRAF6的表达阻断了抑制mi R-146a对EAE的保护作用,而下调mi R-146a或过表达TRAF6均能缓解EAE的病情,说明在EAE的CNS病灶区域,mi R-146a至少部分的通过作用于TRAF6调控中枢内源性1型干扰素系统的表达或分泌参与EAE疾病进程。上述结果表明mi R-146a通过调控TRAF6及1型干扰素的表达及分泌参与EAE疾病进程,抑制中枢mi R-146a的表达会显著减轻EAE的病情,为阐明MS/EAE发病机制以及疾病治疗新靶点的发现奠定基础。