大麻（Cannabis sativa L.）,是大麻科（Cannabinaceace）大麻属（Cannabis）一年生草本植物,在我国有数千年的种植利用历史。以大麻二酚（cannabidiol,CBD）提取为主要目标的药用工业大麻产业,是近几年来新兴的产业。我们在前期的生产和科学试验中发现,收获前受到茎杆机械损伤的大麻雌株,在生物产量不变的情况下,CBD含量高于对照。这一结果不仅可指导生产上提高大麻CBD产量,对研究CBD等大麻次生代谢物的合成调控机制也具有重要价值。因此,本项目对大麻花期雌性植株的茎杆施加机械损伤处理,通过转录组测序、植物激素含量分析、代谢组分析等方法,深入探究大麻在机械损伤情况下,其应激防御系统的应答调控机制,建立大麻再生和遗传转化体系,为了解工业大麻对非生物逆境胁迫的应激防御机制、培育优质工业大麻品种等奠定基础研究。1、机械损伤胁迫影响大麻形态和CBD和THC含量对大麻品系DMG227克隆苗群体开花后第7周（正常收获时间前1周）的大麻植株进行茎杆穿刺损伤处理,对处理后第0D、2D、4D、7D、10D花叶进行了CBD和THC（tetrahydrocannabinol,四氢大麻酚）含量检测,发现大麻CBD和THC含量在处理后2D达到峰值,然后逐渐降低,虽然后期含量有所回升,但无法达到损伤处理2D后的峰值水平。该试验在另一个工业大麻DMG229的克隆苗群体中得到验证:该群体的CBD和THC含量均在损伤后1D和2D达到峰值,之后持续下降,与大麻品系DMG227材料的试验结果一致。2、机械损伤胁迫后大麻差异表达基因增加对茎杆机械损伤处理后第0D、1D、2D的大麻取样进行转录组测序分析,在3个时期的两两比对组中共筛选得到2181个差异表达基因,其中0D vs1D、0D vs 2D差异表达基因分别为518个（其中336个下调,182上调）和1296个（其中1031下调,265上调）。受到机械损伤后2D,大麻中差异表达基因数量是1D差异表达基因数量的2.5倍,而且,这些差异表达基因中,下调表达的基因数目是上调基因数目的3倍。说明受损伤后发生表达变化的基因数量呈现急剧增加的趋势,且表达下调的基因明显多于上调基因,推测植物为了应对茎杆机械损伤,大幅降低了维持原正常生理生化活动的基因表达量,以应对机械损伤。对所有差异表达基因KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析,发现差异基因主要集中在初生代谢和次生代谢物合成两类生物通路,共计占所有差异表达基因数量的75.4%,推测初生和次生代谢途径与大麻响应机械损伤有密切关联。3、机械损伤胁迫后大麻部分内源激素和代谢物含量变化明显对茎杆机械损伤处理后第0D、1D、2D的大麻取样,检测了10种植物激素,并进行了广泛靶向代谢组分析。结果表明,茉莉酸（JA）、茉莉酸-异亮氨酸（JA-ILE）、水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）四种激素含量发生了显著变化;代谢组分析共检测出23类995种代谢物。包括初生代谢物合计432种,次生代谢物合计563种,其中差异代谢物77个。差异代谢物主要集中在初生代谢途径、黄酮类化合物生物合成、次生代谢物的生物合成等,这些差异代谢物富集的生物过程与转录组分析中差异表达基因富集的代谢通路关联度较高。4、联合分析发现次生代谢途径是大麻应对机械损伤胁迫的重要过程对转录组、代谢组、激素测定等结果联合分析发现,大麻受到机械损伤后,各对比组中,皮尔森相关系数大于0.8的差异基因和差异代谢物,均主要富集在以下代谢通路:初生代谢途径、次生代谢产物的生物合成、植物激素信号转导,其中植物激素信号转导为本论文重点研究通路。大麻受到机械损伤后,JA、JA-ILE、SA和ABA等激素含量发生显著变化的同时,许多与植物激素信号传导过程相关的基因发生差异表达。尤其是JA含量在受机械损伤2D后急剧升高,其信号传导相关基因表达也发生变化,与之对应的代谢组分析表明,醇类、醌类、苯丙素、酚胺、生物碱、黄酮醇等次生代谢物含量增加。推测JA、SA、ABA三种激素及其信号传导下游相关的基因,包括次生代谢物合成相关的基因,在大麻的机械损伤响应防御过程中扮演极其重要的角色。推测大麻应激防御机制为:受到茎杆机械损伤后,损伤信号迅速穿过细胞膜,植物激素、活性氧等相关物质发生含量变化,并作为信号,激活相关转录因子,调控下游基因的表达。其中次生代谢相关基因的表达变化是信号传导的重要一环,导致了包括CBD、THC在内的大麻特异性次生代谢物含量提高。与大麻特有次生代谢物代谢途径相关联的其它代谢途径,如黄酮类化合物、萜类化合物等的代谢途径也发生相应关联变化,共同形成应对机械损伤的物质基础。5、大麻CBD合成关键基因CBDAS基因的遗传转化作为再生顽拗型植物之一,大麻的离体再生体系一直是进行遗传转化的瓶颈。本研究建立了一种以无菌苗子叶为外植体的再生体系,最高再生频率达到51.7%,可在短时间内获得平均每外植体2-3个再生芽。该方法使用含0.2 mg/L噻苯隆（TDZ）和0.05 mg/L萘乙酸（NAA）的MS培养基进行再生芽诱导。虽然因基因型不同,再生效率有差异,但总体来说,其离体和高效的特征,使其可有效应用于遗传转化体系的建立,同时也可用于微繁殖和种质保存。以高效离体再生体系为基础,我们应用大麻CBD合成关键基因CBDAS基因的过表达载体,进行了大麻遗传转化体系的建立和优化。研究了外植体预培养、农杆菌浓度和侵染时间等参数对转化效率的影响。优化的遗传转化方案使用预培养1D子叶作为外植体,用OD600值为0.6的农杆菌浸染20 min,在含有100 mmol/L乙酰丁香酮、250 mg/L头孢噻肟、250 mg/L羧苄青霉素、0.2 mg/L TDZ的MS培养基中共培养3天。然后将芽转移到与选择培养相同的培养基中,同时添加35 mg/L潮霉素进行抗性选择。选择培养后存活的芽转移到含有0.1 mg/L吲哚丁酸（IBA）的1/2 MS培养基中进行生根。GUS组织化学分析和PCR检测证实了阳性转化。本研究虽然获得了GUS组织表达的再生植株,也进行了PCR验证,但这些阳性植株多为嵌合体,外源基因的嵌入和表达仅存在于部分组织,且随着世代繁衍,外源基因的表达趋于消失。因此,大麻遗传转化体系还亟待改善和优化。