银杏(Ginkgo biloba L.)是世界著名的孑遗树种,集叶用、材用、观赏、药用价值于一体,具有较高的应用价值。银杏喜温暖凉爽的气候环境,极端温度、盐、干旱等非生物胁迫是银杏栽培中的重要限制因子。WRKY转录因子家族在响应各种胁迫中发挥重要作用。为深入研究银杏WRKY转录因子在非生物胁迫中的功能,本研究鉴定并分析了银杏WRKY转录因子家族成员,筛选到多个响应非生物胁迫的关键WRKY基因。进一步克隆并构建关键基因的表达载体,进行亚细胞定位分析和杨树遗传转化,用于分析WRKY基因在非生物胁迫下的功能。主要取得以下研究结果:(1)利用HMM模型,在银杏基因组中鉴定到37个WRKY转录因子家族成员,根据家族成员在染色体上的位置,依次命名为GbWRKY1～GbWRKY37。染色体定位结果表明,36个GbWRKY基因不均匀的分布在9条染色体上,1个基因(GbWRKY37)位于scaffold1055上。GbWRKY基因序列长度在474 bp～3123 bp之间,外显子含量为2～17个。对银杏WRKY家族成员进行复制基因事件分析,发现20个基因为分散复制,8个基因为串联复制,8个基因为近端复制,1个基因为单拷贝复制。进化树分析显示,银杏WRKY基因家族数目与挪威云杉相近,但显著低于拟南芥和水稻中的WRKY基因数目。(2)基于NCBI注释信息,对银杏WRKY家族潜在靶基因进行了 GO和KEGG富集分析。GO功能富集发现这些基因主要集中在细胞组分中的细胞组分功能、细胞功能,分子功能中的催化活性、结合功能以及涉及生物过程中的代谢过程、细胞进程。另外,在生物过程中有385个靶基因富集到应激反应,83个靶基因富集到信号转导。KEGG通路分析一共注释到了 20条通路,其中主要富集的通路有植物激素信号转导、嘌呤代谢、信使RNA通路、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、光合作用。(3)银杏WRKY基因家族在不同组织间表达差异较大,大部分WRKY基因在根中的表达丰度较高。此外,Group Ⅰ的基因在各组织的表达丰度较其他分支普遍较高,Group Ⅱc的基因在各组织的表达丰度较其他分支普遍较低,各分支内也呈现出较大的组织表达差异。荧光定量PCR分析结果同转录组的数据一致。(4)银杏WRKY基因家族在不同胁迫间表达模式表明,多个银杏WRKY家族基因能够响应非生物胁迫,干旱处理中,筛选到7个差异表达的WRKY基因,其中4个基因为下调表达,3个基因为上调表达;盐处理中,筛选到5个差异表达的基因,其中1个基因为上调表达,其余4个基因为下调表达;在高温处理下,筛选到16个差异表达的基因,其中3个基因为上调表达,其余13个均为下调表达;紫外处理中,筛选到7个差异表达的基因,其中3个基因为上调表达,4个基因下调表达。荧光定量PCR分析进一步证实了这些基因在非生物胁迫中的表达趋势。(5)结合与已知非生物胁迫相关的WRKY基因的结构域比对结果,在银杏中筛选到与极端温度相关的Gb WRKY15、GbWRKY18、GbWRKY37,与盐和干旱胁迫相关的Gb WRKY15、GbWRKY13。结合转录组数据以及荧光定量结果,GbWRKY13、GbRRKY15、GbWRKY18、GbWRKY37四个基因在响应极端温度、盐害、干旱等非生物胁迫中发挥关键作用。银杏WRKY家族与紫外胁迫相关基因亲缘关系较远,根据转录组数据,推测GbWRKY6、Gb WRKY23在响应紫外胁迫中发挥重要作用。(6)进一步进行逆境处理实验,结果显示GbWRKY6和GbWRKY23可迅速显著响应紫外处理,紫外处理3 h时GbWRKY6显著上调表达,而Gb WRKY23显著下调表达。Gb WRKY13、GbWRKY15、GbWRKY18、Gb WRKY37能够迅速响应极端温度、干旱、盐胁迫多个非生物胁迫。GbWRKY13在高温、低温处理1h时均显著下调表达,而在轻度干旱和盐胁迫处理2 h时均显著上调表达。GbWRKY15在高温、低温和盐胁迫处理下显著下调表达,而在轻度干旱下显著上调表达。GbWRKY18和Gb WRKY37在高温处理4 h和低温处理1 h时显著下调表达,而在盐胁迫处理2 h时显著上调表达。(7)挑选出响应非生物胁迫较为显著的GbWRKY13、GbbWRKY15、GbWRKY37进行克隆及过表达载体的构建。亚细胞定位显示GbWRKY13、GbWRKY37在细胞核中有定位且均有较强荧光,GbWRKY15在细胞核和细胞膜中均有定位且荧光非常强。转化杨树(84K杨)后分别获得18、14、16个阳性苗株系,与对照相比,转基因植株的地上部分无显著差异,但根系较为发达,根长和须根数量明显增加,接下来将进一步对转基因株系的抗非生物胁迫能力进行研究。