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目的:氯胺酮(ketamine)作为一种非竞争性NMDA(N-methyl-D-aspartate)受体阻滞剂,可产生剂量相关的意识和感觉分离的麻醉状态,广泛用于成人和小儿麻醉。然而越来越多的研究结果显示,全身麻醉药氯胺酮可导致神经损伤,引起神经退行性疾病和长期的神经认知缺陷。因此对氯胺酮神经毒性的研究引起人们的关注。已有研究报道氯胺酮可导致啮齿类、斑马鱼、非人类灵长类神经细胞凋亡。细胞凋亡是细胞死亡的主要形式之一,有关细胞凋亡的发生机制尚未充分阐明。现在认为有三条细胞信号通路参与凋亡的发生:即线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路。有研究报道氯胺酮可通过线粒体途径导致体外培养的人胚胎干细胞发生凋亡,但氯胺酮是否可以通过内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)途径诱导细胞凋亡还未明确。已有研究表明,氧自由基、应激激素和细胞因子等都可以影响内质网功能,导致未/错误折叠蛋白堆积,激活内质网应激。适度的内质网应激可提高内质网处理未折叠或错误折叠蛋白的能力,维持细胞的生存;如果应激程度过强或时间过长,细胞内的稳态不能恢复,内质网应激最终将导致细胞发生凋亡。在一些神经退行性疾病如帕金森病,阿尔茨海默病和亨廷顿病等的发病机制研究中已证实内质网应激可以引起神经细胞的凋亡。葡萄糖调节蛋白78(78-kDa glucose-regulated protein,GRP78),也被称为免疫球蛋白重链结合蛋白(Immunoglobulin heavy chain binding protein,Bip),是未折叠蛋白反应的主调控者。当钙超载、氧化应激等因素导致内质网腔中未折叠蛋白聚集时,GRP78/Bip释放跨膜蛋白,引起ERS激活。因此,GRP78/Bip被视为ERS的标志性蛋白。Caspase12是caspase家族成员,它仅产生于内质网。Caspase12仅在内质网应激时被活化,是内质网应激介导凋亡途径的关键蛋白酶。基于以上研究背景,本实验中我们研究氯胺酮对PC12细胞的毒性作用,观察内质网应激在氯胺酮诱导PC12细胞损伤的过程中是否发挥了作用,为氯胺酮神经毒性机制研究提供新的思路。方法:1MTT实验观察0.5、1、1.5、2、2.5mM氯胺酮分别作用6、12、24h对PC12细胞存活率的影响;20、30、40M Salubrinal(内质网应激抑制剂)单独或与氯胺酮共同作用对PC12细胞存活率的影响。2Western blot方法检测内质网应激标志分子GRP78/Bip、内质网应激介导凋亡分子Caspase12蛋白的表达:1、1.5、2mM氯胺酮作用24h对PC12细胞GRP78/Bip、Caspase12蛋白的影响;1.5mM氯胺酮作用6、12、24h对PC12细胞GRP78/Bip、Caspase12蛋白的影响;加用内质网应激抑制剂Salubrinal共同作用于PC12细胞后对两种蛋白的影响。3为了明确氯胺酮是否导致了PC12细胞的凋亡,采用流式细胞术Annexin V-PI双标染色法检测PC12细胞凋亡率,并观察内质网应激抑制剂Salubrinal对氯胺酮所致PC12细胞凋亡的影响。4数据用均数±标准差(Mean±SD)表示,用SPSS17.0软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),以p<0.05为差异有统计学意义。结果:1PC12细胞存活率的变化:与正常对照组相比,0.5mM氯胺酮作用于PC12细胞6h后细胞存活率没有明显变化(p>0.05),作用12、24h后,PC12细胞存活率明显降低(p<0.05);1、1.5、2、2.5mM氯胺酮作用于PC12细胞6、12、24h后,PC12细胞存活率明显降低(p<0.05),且呈浓度依赖性;20、30、40M Salubrinal单独作用于PC12细胞24h对其存活率无明显影响;30或40M Salubrinal可抑制1.5mM氯胺酮所致PC12细胞存活率的下降(p<0.05)。2内质网应激标志分子GRP78/Bip蛋白表达的变化:与正常对照组相比,1.5、2mM氯胺酮作用于PC12细胞24h后,GRP78/Bip蛋白表达明显增高(p<0.05or p<0.01),呈浓度依赖性;1.5mM氯胺酮作用于PC12细胞12、24h后,GRP78/Bip蛋白表达明显增高(p<0.05or p<0.01),呈时间依赖性;30M Salubrinal可抑制1.5mM氯胺酮所致PC12细胞GRP78/Bip蛋白表达的增高。内质网应激介导凋亡分子Caspase12蛋白表达的变化:与正常对照组相比,1.5、2mM氯胺酮作用于PC12细胞24h后,Caspase12蛋白表达明显增高(p<0.05),呈浓度依赖性;1.5mM氯胺酮作用于PC12细胞6、12、24h后,Caspase12蛋白表达明显增高(p<0.05),呈时间依赖性;30M Salubrinal可抑制1.5mM氯胺酮所致PC12细胞Caspase12蛋白表达的增高。3PC12细胞凋亡率的变化:与对照组相比,1.5mM氯胺酮作用24h后PC12细胞总凋亡率明显升高(p<0.05);30M Salubrinal可抑制1.5mM氯胺酮所致PC12细胞凋亡率的增高(p<0.05);30M Salubrinal单独作用后细胞凋亡率较对照组相比差异无统计学意义(p>0.05)。结论:氯胺酮可诱导PC12细胞发生凋亡,且呈浓度依赖和时间依赖性;内质网应激介导了氯胺酮诱导的PC12细胞凋亡。