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体细胞克隆猪在人的动物疾病模型和人类异种器官移植方面具有巨大优势和应用潜力,已经成为当今体细胞克隆领域研究的热点。虽然体细胞克隆猪在几个国家已获得成功,但其克隆效率仍很低(1-2%)。本研究以建立高效的猪体细胞核移植技术体系为目的,系统地研究了影响猪体细胞核移植效率的因素,通过优化相关技术,改善培养条件,达到稳定、大量地生产克隆胚胎,并进行胚胎移植以期获得克隆猪的出生。本研究利用组织块法建立了广西巴马香猪的40d胎儿成纤维细胞系、成年耳成纤维细胞系,以机械刮取法建立了输卵管上皮细胞系,并分离培养了猪卵泡液中的颗粒细胞。研究了冻存对胎儿成纤维细胞的影响以及胎儿成纤维细胞的生长曲线和染色体倍性。实验结果表明,冻存后的胎儿成纤维细胞仍能保持良好的生长状态,细胞生长曲线呈典型的S型,在传代10次之前,染色体倍性正常的比例在92%以上。利用脂质体法转染了质粒pEGFP-cl,研究了细胞密度、DNA、脂质体的用量、DNA脂质体复合物的暴露时间对转染效率的影响。结果表明：24孔板内细胞汇合85%-90%,1.0μg DNA和2.4μL脂质体的用量,暴露4h转染效率最高。优化了卵母细胞体外成熟体系：在NCSU-23+10%PFF中培养的卵母细胞成熟率最高(79.08%),FBS对卵母细胞体外成熟作用不大；成熟培养液NCSU-23的成熟培养效果略高于TCM 199；在NCSU-23培养液中添加EGF对成熟效率影响不大。经多次孤雌激活实验表明,以200V/mm,60μs,1DC的处理效果最佳；电激活后分别在成熟培养液中添加2mM 6-DMAP进行化学处理,所得的卵裂率略高于对照组、囊胚率显著高于对照组；20μM/L离子霉素激活处理40min激活效果最好；体外成熟培养36h、40h、52h的卵母细胞在卵裂率和囊胚率上明显不如44h、48h,成熟培养48h的卵母细胞卵裂率最高可达81.75%,44h囊胚率最高为22.22%。血清饥饿法和接触抑制法对供核细胞进行细胞周期化处理,诱导细胞进入G0/G1期。各组之间的卵裂率、囊胚率差异不显著,经血清饥饿的供体细胞所得的囊胚率较高。比较了盲吸法、Spindle-view去核法,发现Spindle-view法的去核率可以达到95.76%,是一种安全、高效的去核方法。以胎儿成纤维细胞作为供核体细胞构建的重构胚后期发育效果良好；10代以内的胎儿成纤维细胞更有利于重构胚的发育,融合率、卵裂率和囊胚率都很高。200v,60us,1DC电激活后,在以B2为培养基的培养体系中进行培养,无论在重构胚的融合率、卵裂率和囊胚率上均高于NCSU-23,但差异不显著。从实验成本考虑,采用传统的NCSU-23培养基是可行的。在以上实验的基础上,对实验室获得的早期重构胚胎(1-4细胞胚胎)进行了手术法胚胎移植。移植受体母猪(上海白猪)12头,结果有一头猪顺利怀孕到终期,经剖腹产产下一头健康的克隆巴马小型猪,还有另外三头母猪于移植后51 d、76 d和77d返情,怀孕率33.3%。