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器官移植作为现代医学的重大进步，已经广泛应用于治疗各种终末期器官功能衰竭的病人。然而移植排斥反应仍然是目前器官移植领域的最大难题。免疫抑制剂的使用虽然降低了排斥反应的发生率，但是却带来许多难以克服的副作用。目前移植学界普遍认为解决移植排斥反应的最终出路在于诱导受体产生免疫耐受。免疫耐受作为一种特殊的免疫应答，其诱导方式具有一定的复杂性。T细胞处于免疫排斥反应中心环节，其激活过程一方面需要TCR与MHC-多肽复合物的特异性结合，另一方面还需要共刺激通路的信号放大作用。未成熟树突状细胞表面缺乏B7-1、B7-2和CD40等共刺激分子，在异体移植时，不能有效递呈抗原，激活T细胞，导致免疫耐受的形成。未成熟树突状细胞被视为诱导免疫耐受的有效手段。另一方面，大量临床观察和实验已经证实异基因嵌合体与成功的免疫耐受之间关系密切。骨髓细胞中含有大量造血干细胞，具有很强的增殖与分化潜能，容易形成嵌合体而诱导免疫耐受。因此骨髓移植也被视为诱导免疫耐受的重要手段之一。鉴于此，我们考虑在大鼠异体肾脏移植模型上，利用供体来源的未成熟树突状细胞诱导受体T细胞低应答的特性，在这一短暂的免疫低反应期内，联合骨髓移植，使得异基因细胞在受体内生存并繁殖，从而建立稳定的免疫耐受状态，为临床延长移植肾脏存活时间提供新思路。第一部分 体外未成熟树突状细胞的培养、鉴定和功能评价目的：体外采用抑制性细胞因子白介素－10（IL-10）抑制树突状细胞成熟过程，观察未成熟树突状细胞的表型和体外免疫调节功能，为进一步诱导大鼠异体肾脏移植免疫耐受提供理论依据和治疗手段。方法：1. 大鼠骨髓细胞的制备：无菌取大鼠胫骨和股骨骨髓，0.83% Tris-NH4Cl溶液使红细胞充分溶解。离心后重复洗涤一次。调整细胞浓度为2×108/ml备用。<WP=7>2. 未成熟树突状细胞的培养：按上法取新鲜骨髓细胞，经小鼠抗大鼠系列单抗和补体，将剩余阴性选择的细胞加入正常人血清包板的培养皿中，1h后吸取上清中非贴壁细胞。含rrGM-CSF（10ng/ml）、rrIL-4（8ng/ml）的RPMI1640培养基调整细胞浓度至1×106/ml，置于1%明胶包板的6孔板中培养；培养至第5天，收集疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，按加入细胞因子不同分为两组：IL-4组， 继续在原培养基中培养；IL-10组，上述培养基中加入IL-10（10ng/ml），培养至第13天，收集细胞。3. 树突状细胞纯度和表型分析： 分别收集不同培养条件下树突状细胞，加入PE或FITC标记的抗大鼠CD80、CD86、OX6、OX62单克隆抗体，流式细胞仪（FACScan USA）进行表型分析。4. 树突状细胞吞噬功能分析：分别收集不同培养条件下树突状细胞，加入FITC-Dextran，置于4℃（对照组）和37℃（实验组）。2h后取出，流式细胞仪定量分析树突状细胞吞噬功能。5. 初次混合淋巴细胞反应：分别收集不同培养条件下Lewis大鼠树突状细胞，灭活增殖性，作为刺激细胞。取正常DA大鼠脾脏，尼龙毛吸附法制备纯化T细胞，作为反应细胞。刺激细胞与反应细胞按1:10、1:20和1:40混合培养，β-液体闪烁计数仪测定CPM值，计算刺激指数（SI）。6. 再次混合淋巴细胞反应：上述刺激细胞与反应细胞按1:10共同培养5天，作为再次反应细胞。Lewis、DA及无关第三品系Wistar大鼠来源的脾淋巴细胞，灭活增殖性，作为再次刺激细胞。再次刺激细胞与再次反应细胞以1:1、1:2、1:4及1:8混合培养，做再次MLR。计算刺激指数（SI）。7. T细胞杀伤活性测定：利用51Cr释放实验测定CTL细胞毒效应。再次反应细胞作为效应细胞；Na251CrO4标记的Lewis、Wistar及DA大鼠来源的脾淋巴细胞作为靶细胞。效应细胞：靶细胞为20:1，γ计数仪测定CPM值，计算杀伤率。8. 树突状细胞培养上清IL-12水平检测:在树突状细胞培养不同时间分别收集IL-4组和IL-10组半量换液之离心上清，IL-12检测采用抗体夹心ELISA法。9. 初次反应细胞上清IL-2水平检测:细胞培养上清IL-2水平检测采用双抗体夹心ELISA法。结果：不同细胞因子刺激下和不同培养时间树突状细胞的生长情况和形态：大鼠树突状细胞呈现半悬浮生长状态。培养至第3天，可见部分细胞附壁生长，在第5天出现毛刺状细胞，随着培养时间的延长，IL-4组此类细胞数量增多，毛刺状突起更加明显，并逐渐脱壁；至第13天，可以观察到形态<WP=8>1. 均一、毛刺状聚集成簇的成熟树突状细胞；IL-10组树突状细胞毛刺状和聚集体不明显，仍停留在未成熟状态。2. 树突状细胞表型分析： IL-4组及IL-10组树突状细胞在培养结束时表面表达OX62（大鼠树突状细胞表面标志）的细胞比率分别为82.3%±6.7%和79.6%±4.6%，两组比较，无明显差异（P>0.05），说明利用IL-10不影响树突状细胞分化与扩增，可以获得较高纯度的未成熟树突状细胞。IL-4组共刺激分子CD80和CD86表达水平分别为60.2±7.1％和72.4±8.3％，MHC-II类分子OX6表达水平为61±4.5％；IL-10组树突状细胞表面CD80和CD86表达水平分别为25.3±4.6％和42.4±5.2％，OX6表达水平为32.3±9.6％；两组比较，差异具有显著性（P<0.01），说明IL-10能够抑制树突状细胞的成熟过程，阻断其表面共刺?