人脂肪来源的间充质干细胞通过分泌TGF-β1影响乳腺癌细胞的侵袭和转移

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wxhex2008
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目的:乳腺癌是一种恶性肿瘤,如果控制不佳则会发生侵袭与转移,带来严重后果。上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是细胞上皮特征逐渐被间质表型所取代的过程,该过程与乳腺癌的转移和侵袭密切相关。目前研究表明,肿瘤微环境在调节细胞EMT过程中起到了重要的作用。间充质干细胞(mesenchymal tem cells,MSCs)是一类非造血细胞,除了具有自我更新和向不同结缔组织细胞分化的能力,还具有向肿瘤部位归巢的能力。这些细胞具有免疫调节的旁分泌作用,能够分泌核苷酸,生长因子,细胞因子和趋化因子等刺激肿瘤细胞和/或具有促肿瘤或抗肿瘤的邻近细胞,甚至能够影响肿瘤细胞表型。脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)为白色脂肪组分之一,存在于乳腺局部脂肪中,可能无限接近乳腺肿瘤发生的部位,因此研究ADSCs对乳腺癌细胞的影响具有重要的意义。目前,ADSCs对乳腺癌细胞的作用机制尚不完全清楚,因此,明确乳腺癌微环境中ADSCs与肿瘤细胞的相互作用,在肿瘤的进展和肿瘤治疗的研究中,具有重要意义。方法:未进行共培养的乳腺癌MCF7细胞及MDA-MB-231细胞作为对照组,与Hu-ADSCs进行Transwell隔离共培养72小时的乳腺癌细胞作为实验组。1、应用胶原酶消化法,从人脂肪中分离出ADSCs,进行细胞表面标志和多向分化潜能的鉴定;2、应用细胞增殖的方法对P3、P5以及P7代的ADSCs进行生长曲线测定;3、利用Transwell迁移、侵袭实验检测对照组及实验组细胞24小时、48小时的迁移及侵袭情况,明确ADSCs是否对MCF7细胞及MDA-MB-231细胞具有促迁移和侵袭的作用;4、应用细胞增殖的方法检测Hu-ADSCs是否促进了乳腺癌细胞的增殖,以排除增殖对迁移和侵袭实验的影响;5、应用Real-time PCR在转录水平检测两组细胞的上皮标志E-cadherin、间质标志N-cadherin及EMT相关转录因子Snail、Slug及Twist的表达,明确Hu-ADSCs是否促进了乳腺癌细胞的EMT;6、制备Hu-ADSCs的24小时、48小时、72小时的条件培养基,与空白对照基础培养基相比,明确ADSCs是否具有分泌TGF-β1的功能;7、利用Western blot检测ADSCs对乳腺癌细胞EMT的作用机制,共培养体系中加入TGF-β1的中和抗体anti-TGF-β1或PI3K抑制剂LY294002。检测各组细胞上皮标志E-cadherin、间质标志N-cadherin及EMT相关转录因子Snail、Slug及Twist,通路相关蛋白p-Smad,总Smad,p-AKT,总AKT。明确Hu-ADSCs是否在蛋白水平促进了乳腺癌细胞的EMT,以及Hu-ADSCs的旁分泌作用是否通过TGFβ/Smad和非Smad依赖的TGFβ/PI3K/AKT信号通路作用于乳腺癌细胞。结果:1、原代培养的Hu-ADSCs呈长梭形,形态均一,有伪足,呈单层、旋涡样生长,可向脂肪细胞和成骨细胞分化;2、流式检测Hu-ADSCs阳性表达CD73、CD90、CD105;几乎不表达CD34、CD45、HLA-DR;3、生长曲线显示P3、P5、P7代的Hu-ADSCs均在2d后增殖加快,5d后细胞生长速度变慢,进入平台期。P3和P5代细胞增殖差异不显著(P>0.05),P7代细胞增殖较慢,差异明显(P<0.05);4、培养的MCF7细胞与MDA-MB-231细胞均贴壁生长,MCF7细胞形态偏圆,MDA-MB-231细胞形态偏梭形;5、体外迁移及侵袭实验表明与Hu-ADSCs共培养的MCF7及MDA-MB-231细胞较对照组发生了明显的迁移和侵袭(P均<0.01);6、细胞增殖实验显示Hu-ADSCs促进了MDA-MB-231细胞的增殖(P<0.05),但是对MCF7细胞增殖无影响(P>0.05)。因此不能排除迁移或侵袭的MDA-MB-231细胞是否由细胞增殖引起,所以后续实验应用MCF7细胞进行;7、Real-time PCR显示与Hu-ADSCs共培养的MCF7细胞E-cadherin显著下调,而N-cadherin及EMT相关转录因子Snail、Slug及Twist均上调(P均<0.01);8、ELISA实验表明Hu-ADSCs能够分泌TGF-β1,推测这种旁分泌作用能够影响乳腺癌细胞的迁移和侵袭;9、Western blot显示与Hu-ADSCs共培养后的MCF7细胞的上皮标志E-cadherin表达明显降低(P<0.01),但是在共培养体系中加入TGF-β1的中和抗体anti-TGF-β1或者PI3K抑制剂LY294002后,这种现象明显被逆转(P均<0.01);而间质标志N-cadherin及EMT相关转录因子Snail、Slug及Twist的表达与上述现象正好相反(P均<0.01)。同时通路相关磷酸化蛋白p-Smad2/3和p-AKT,在共培养的MCF7细胞中均显著上调(P均<0.01),并且同样可以被anti-TGF-β1或者PI3K抑制剂LY294002所逆转(P均<0.05)。共培养体系中加入anti-TGF-β1,MCF7细胞的P-AKT也明显下降(P<0.01),这意味着Hu-ADSCs不仅通过TGFβ/Smad信号通路,也通过PI3K/AKT信号通路促进乳腺癌细胞的EMT过程。结论:1、我们通过胶原酶消化法成功培养出原代Hu-ADSCs,P3、P5代细胞的增殖能力明显高于P7代细胞;2、Hu-ADSCs促进了乳腺癌细胞MCF7细胞的迁移、侵袭及MDA-MB-231的增殖;3、Hu-ADSCs分泌的TGF-β1分别通过Smad依赖性和非Smad依赖性通路PI3K/AKT信号通路促进了MCF7细胞的EMT。
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