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壬基酚（NP）作为一种环境雌激素，具有类似17β-雌二醇的结构，并且据报道可以发挥异雌激素作用，从而影响机体的内分泌系统。目前有关NP对生殖系统损害的研究主要集中在对雄性生殖系统损害方面，关于NP对雌性生殖系统损害的研究相对较少，且仅停留在激素分泌、形态等方面，具体作用机制尚不明确。目前，体内研究表明，NP暴露导致雌性大鼠卵巢组织氧化损伤，动情周期延长，类固醇激素分泌紊乱，闭锁卵泡数明显增多，妊娠率显著降低等异常改变。卵巢作为雌性的生殖腺，一方面产生生殖细胞，另一方面分泌雌、孕激素以维持正常的雌性生殖功能，常常是环境雌激素选择性作用的靶点。并且本课题组前期研究表明，NP 在雌性大鼠体内的主要靶器官为卵巢。因此，深入探究 NP 对卵巢的毒性作用及其分子机制显得迫切而有必要。卵巢颗粒细胞（GCs）是卵巢卵泡内最主要的功能细胞，其增殖与分化直接影响卵泡的生长发育、排卵以及类固醇激素分泌等活动，并且卵巢 GCs 通过凋亡和自噬的共同作用导致卵泡闭锁和卵巢早衰。
本研究通过建立原代大鼠卵巢颗粒细胞体外培养体系，观察 NP对体外培养的原代大鼠卵巢GCs的一般毒性效应，测定卵巢GCs类固醇激素分泌水平及合成通路基因和类固醇激素受体的表达情况，研究卵巢GCs增殖、凋亡和自噬相关蛋白的表达水平。从细胞和分子水平系统地探讨NP对类固醇激素分泌水平和颗粒细胞凋亡和自噬的作用机制，探讨NP的雌性生殖毒性作用。
本研究主要内容如下：
一、壬基酚对大鼠卵巢GCs类固醇激素合成的影响
20-30天的雌性Sprague Dawley（SD）大鼠经过24h的适应性喂养后，用1ml注射器注射40IU的孕马血清促性腺激素（PMSG）刺激大鼠的卵泡发育，48h后通过颈椎脱臼法处死大鼠，然后通过卵泡穿刺法获得原代大鼠卵巢GCs。将获得的卵巢GCs在含有15%的胎牛血清（FBS）和1%（青霉素+链霉素）的DMEM-F12培养基中重悬，通过台盼蓝染色法鉴定细胞活力，之后放入37℃、含5%CO2的细胞培养箱中培养，每隔24h换液。待卵巢GCs长到特定密度后，通过免疫荧光的方法鉴定卵巢GCs的纯度。卵巢GCs在浓度为0-100 μM的NP诱导下的持续24h，使用CCK-8细胞增殖测定法测定卵巢GCs的活力。通过ELISA试剂盒检测大鼠卵巢GCs分泌的雌二醇（E2）和孕酮（P4）水平，并通过免疫细胞化学法测定卵巢 GCs 中 ER、PR 和 FSHR 的表达。最后通过Western blot测定类固醇激素生成通路相关蛋白STAR，P450scc，3β-HSD，17β-HSD、PPARγ和P450arom的蛋白质水平。
结果显示，当NP处理浓度大于40 μM时，NP以剂量依赖的方式显著降低了卵巢GCs的活力，为了进一步开展后续的研究，综合考虑相关文献以及CCK-8的实验结果，我们采用30-、50-和70μM NP进行以下实验。ELISA实验结果表明，30-70μM NP处理显著刺激了大鼠卵巢GCs中E2的分泌，50μM和70μM NP处理使P4的水平显著增高。NP处理24h后促进了类固醇激素生产过程中类固醇激素受体FSHR、ER和PR的表达，同时，类固醇激素合成通路相关蛋白 STAR，P450scc，3β-HSD，17β-HSD 和P450arom的表达显著升高。这些结果表明，卵巢GCs暴露于NP可能通过影响类固醇激素受体以及类固醇合成通路相关蛋白的表达来刺激类固醇激素的分泌，进而影响卵巢GCs的功能。
二、壬基酚致卵巢GCs凋亡、自噬及其分子机制研究
异雌激素NP可以诱发雌性大鼠的生殖功能障碍，但造成这种现象的根本机制尚待探索。细胞凋亡和自噬是程序性细胞死亡（PCD）的两种主要形态特征，在女性生殖功能的生长和发育过程中发挥着重要作用，而氧化应激，包括活性氧（ROS）的产生，可以诱导细胞凋亡和自噬。卵巢GCs的增殖和分化对于卵泡发育和排卵至关重要，因此我们研究了NP对大鼠卵巢GCs凋亡、细胞周期、自噬和ROS产生的影响及其潜在的机制。
研究发现，在体外卵巢GCs以30-70 μM的NP处理24h后，显著增加了大鼠卵巢GCs内ROS的产生。与对照组相比，NP暴露导致细胞G0/G1和S期的百分比以剂量依赖的方式降低，G2/M期的百分比显著增加，并且周期相关蛋白p21显著升高，而Cyclin D1显著下降，抑制细胞周期的进展。NP处理显著增加了卵巢GCs的凋亡率，Western blot结果显示，当分别用50 μM和70 μM NP处理时，抗凋亡蛋白Bcl-2的水平显著降低，而促凋亡蛋白 Bax 呈剂量依赖性增加。而且，NP 以剂量依赖性方式显著上调了Cleaved-Caspase-3的水平。
NP暴露使卵巢GCs中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3B-II的表达以及LC3B-II/LC3B-I的比值显著增加（P<0.05）。通过透射电子显微镜（TEM）进一步研究了NP对大鼠卵巢GCs自噬的影响，我们注意到NP刺激了卵巢GCs中自噬体和溶酶体的形成。当用50μM和70μM NP处理卵巢GCs时，我们观察到自噬空泡增加，胞内细胞器减少，含有细胞内成分和细胞器的典型自噬体的形成明显增加。此外，70 μM NP暴露导致了卵巢GCs中晚期自噬溶酶体的形成。
此外，NP上调了p-AMPK/AMPK的比值，并且下调了PI3K的表达以及p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR的比值。但是，当通过使用N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）阻断ROS产生后，可以抑制 NP 诱导的卵巢 GCs 凋亡和自噬。并且，NP 对大鼠卵巢 GCs 中Akt/AMPK/mTOR信号通路的影响可以通过NAC处理来有效逆转。为了研究自噬在NP诱导的卵巢GCs凋亡中的作用，我们采用自噬抑制剂3-MA来抑制NP诱导的卵巢GCs的自噬，结果发现3-MA处理增强了NP诱导的卵巢GCs的凋亡。
我们的研究结果表明，NP可以同时促进大鼠卵巢GCs的凋亡和自噬，这可能与干扰ROS依赖的Akt/AMPK/mTOR通路的信号传导有关。而且自噬的激活可能会发挥细胞保护机制，以改善NP诱导的大鼠卵巢GCs的凋亡。
本研究通过建立原代大鼠卵巢颗粒细胞体外培养体系，观察 NP对体外培养的原代大鼠卵巢GCs的一般毒性效应，测定卵巢GCs类固醇激素分泌水平及合成通路基因和类固醇激素受体的表达情况，研究卵巢GCs增殖、凋亡和自噬相关蛋白的表达水平。从细胞和分子水平系统地探讨NP对类固醇激素分泌水平和颗粒细胞凋亡和自噬的作用机制，探讨NP的雌性生殖毒性作用。
本研究主要内容如下：
一、壬基酚对大鼠卵巢GCs类固醇激素合成的影响
20-30天的雌性Sprague Dawley（SD）大鼠经过24h的适应性喂养后，用1ml注射器注射40IU的孕马血清促性腺激素（PMSG）刺激大鼠的卵泡发育，48h后通过颈椎脱臼法处死大鼠，然后通过卵泡穿刺法获得原代大鼠卵巢GCs。将获得的卵巢GCs在含有15%的胎牛血清（FBS）和1%（青霉素+链霉素）的DMEM-F12培养基中重悬，通过台盼蓝染色法鉴定细胞活力，之后放入37℃、含5%CO2的细胞培养箱中培养，每隔24h换液。待卵巢GCs长到特定密度后，通过免疫荧光的方法鉴定卵巢GCs的纯度。卵巢GCs在浓度为0-100 μM的NP诱导下的持续24h，使用CCK-8细胞增殖测定法测定卵巢GCs的活力。通过ELISA试剂盒检测大鼠卵巢GCs分泌的雌二醇（E2）和孕酮（P4）水平，并通过免疫细胞化学法测定卵巢 GCs 中 ER、PR 和 FSHR 的表达。最后通过Western blot测定类固醇激素生成通路相关蛋白STAR，P450scc，3β-HSD，17β-HSD、PPARγ和P450arom的蛋白质水平。
结果显示，当NP处理浓度大于40 μM时，NP以剂量依赖的方式显著降低了卵巢GCs的活力，为了进一步开展后续的研究，综合考虑相关文献以及CCK-8的实验结果，我们采用30-、50-和70μM NP进行以下实验。ELISA实验结果表明，30-70μM NP处理显著刺激了大鼠卵巢GCs中E2的分泌，50μM和70μM NP处理使P4的水平显著增高。NP处理24h后促进了类固醇激素生产过程中类固醇激素受体FSHR、ER和PR的表达，同时，类固醇激素合成通路相关蛋白 STAR，P450scc，3β-HSD，17β-HSD 和P450arom的表达显著升高。这些结果表明，卵巢GCs暴露于NP可能通过影响类固醇激素受体以及类固醇合成通路相关蛋白的表达来刺激类固醇激素的分泌，进而影响卵巢GCs的功能。
二、壬基酚致卵巢GCs凋亡、自噬及其分子机制研究
异雌激素NP可以诱发雌性大鼠的生殖功能障碍，但造成这种现象的根本机制尚待探索。细胞凋亡和自噬是程序性细胞死亡（PCD）的两种主要形态特征，在女性生殖功能的生长和发育过程中发挥着重要作用，而氧化应激，包括活性氧（ROS）的产生，可以诱导细胞凋亡和自噬。卵巢GCs的增殖和分化对于卵泡发育和排卵至关重要，因此我们研究了NP对大鼠卵巢GCs凋亡、细胞周期、自噬和ROS产生的影响及其潜在的机制。
研究发现，在体外卵巢GCs以30-70 μM的NP处理24h后，显著增加了大鼠卵巢GCs内ROS的产生。与对照组相比，NP暴露导致细胞G0/G1和S期的百分比以剂量依赖的方式降低，G2/M期的百分比显著增加，并且周期相关蛋白p21显著升高，而Cyclin D1显著下降，抑制细胞周期的进展。NP处理显著增加了卵巢GCs的凋亡率，Western blot结果显示，当分别用50 μM和70 μM NP处理时，抗凋亡蛋白Bcl-2的水平显著降低，而促凋亡蛋白 Bax 呈剂量依赖性增加。而且，NP 以剂量依赖性方式显著上调了Cleaved-Caspase-3的水平。
NP暴露使卵巢GCs中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3B-II的表达以及LC3B-II/LC3B-I的比值显著增加（P<0.05）。通过透射电子显微镜（TEM）进一步研究了NP对大鼠卵巢GCs自噬的影响，我们注意到NP刺激了卵巢GCs中自噬体和溶酶体的形成。当用50μM和70μM NP处理卵巢GCs时，我们观察到自噬空泡增加，胞内细胞器减少，含有细胞内成分和细胞器的典型自噬体的形成明显增加。此外，70 μM NP暴露导致了卵巢GCs中晚期自噬溶酶体的形成。
此外，NP上调了p-AMPK/AMPK的比值，并且下调了PI3K的表达以及p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR的比值。但是，当通过使用N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）阻断ROS产生后，可以抑制 NP 诱导的卵巢 GCs 凋亡和自噬。并且，NP 对大鼠卵巢 GCs 中Akt/AMPK/mTOR信号通路的影响可以通过NAC处理来有效逆转。为了研究自噬在NP诱导的卵巢GCs凋亡中的作用，我们采用自噬抑制剂3-MA来抑制NP诱导的卵巢GCs的自噬，结果发现3-MA处理增强了NP诱导的卵巢GCs的凋亡。
我们的研究结果表明，NP可以同时促进大鼠卵巢GCs的凋亡和自噬，这可能与干扰ROS依赖的Akt/AMPK/mTOR通路的信号传导有关。而且自噬的激活可能会发挥细胞保护机制，以改善NP诱导的大鼠卵巢GCs的凋亡。