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本论文利用PCR扩增了刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)S08-4中700 bp的SAM-s(S-adenosylmethionine synthetase)基因和400 bp的ssgA-sp(for sporulation of Streptomyces griseus)基因,并将SAM-s基因以正确的读码框架克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a(+)T7启动子下游的NdeⅠ和BamHⅠ位点之间,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导后超量表达了25 kDa大小的重组蛋白,但以无活性的包涵体形式存在。
为了进一步研究这两个重要调控基因的功能,首先需要构建一个合适的链霉菌表达载体。本研究从质粒pLSB2出发,该质粒由大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pCJR24衍生而来,它含有来自天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)放线紫红素(Act)生物合成基因簇的途径专一性激活基因actⅡ-ORF4,以及PactⅢ/PactⅠ双向启动子。因此在载体pLSB2的基础上,通过插入整合酶ФC31 int和attP site,构建了能在大肠杆菌和链霉菌间进行接合转移,并能整合到链霉菌染色体上的高效表达载体pMF。用pMF转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)后,分别与天蓝色链霉菌M145及其ssgA基因阻断株GSA3、变铅青链霉菌(S.lividans)TK24、红色糖多孢菌(Sacc.erythraea)2338接合,均能得到数量很多的接合子,说明构建的质粒载体pMF有着较广范围的宿主菌,都能成功整合到链霉菌的染色体上。
将来自刺糖多孢菌的SAM-s基因和ssgA-sp基因通过NdeⅠ/XbaⅠ酶切位点克隆至pMF的actⅡ-ORF4/PactⅠ启动元件下游,通过接合转移转入天蓝色链霉菌M145中。对原始菌株和接合子进行固体平板培养和液体摇瓶发酵培养,并进行了抗生素含量测定和菌体形态观察,结果:(1)接合子M145/pMFsam的Act摇瓶发酵产量是对照株M145/pMF的3.2倍,而两株对照菌株M145和M145/pMF之间并没有很大差别。转接GYM和R4C平板培养,观察色素和孢子形成情况,发现转化子M145/pMFsam的孢子形成受到了明显的抑制,并且Act和Red两种色素的形成起始时间比两株对照菌都要早。(2)ssgA-sp基因能互补GSA3菌株因ssgA基因破坏所引起的缺陷表型,并且ssgA-sp的过量表达能引起变铅青链霉菌菌丝形态发生较大改变,营养菌丝无明显结团。
本研究首次从刺糖多孢菌中克隆了这两个潜在的调控基因,并且在链霉菌模式菌株中进行了初步的功能研究,为后续的研究工作奠定了基础。