乳腺癌是威胁妇女健康和生命的常见恶性肿瘤之一,而抑郁焦虑障碍广泛存在于乳腺癌患者当中。研究表明长期的抑郁焦虑状态将对乳腺癌患者的免疫功能产生很大的负向调节作用,在疾病的进展中扮演着重要角色。髓系来源的免疫抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一群特异的免疫抑制细胞,近年来在免疫和肿瘤的研究中逐渐成为热点。自然杀伤T细胞(Natural killer T,NKT),是一群兼具NK细胞和T细胞特征的免疫细胞,包括两个亚型,能正向或负向调节机体免疫,故在肿瘤的免疫调节中是一把“双刃剑”。乳腺癌患者在肿瘤微环境下,能产生大量的炎性因子,这些炎性因子能募集、扩增和激活MDSC,启动免疫抑制功效,促进肿瘤的进展和逃逸。抑郁障碍会加重炎性因子分泌,加重免疫抑制效应。改善乳腺癌患者的抑郁状态,重塑NKT细胞的功能,可以加强拮抗MDSC的免疫效应,从而促进正常免疫功能的发挥,最终起到抗肿瘤的效应。抑郁焦虑障碍属于中医肝郁范畴,临床乳腺癌患者常常合并脾虚表现,本研究所用的处方是我科治疗肝郁脾虚型乳腺癌的经验方。在我们的前期研究工作中,已经在持续抑郁模型(抑郁造模中期接种4T1细胞)和瘤后抑郁模型(接种4T1细胞后进行抑郁造模)中,对本方在乳腺癌DSC-NKT细胞免疫重塑调控的机理研究取得了良好的结果。前期研究显示,疏肝健脾方(或联合吉西他滨化疗)对抑郁荷瘤模型进行干预后,能下调炎性因子如IL-13、IL-6等的表达,下调脾脏中MDSC的表达,上调T细胞的亚群的表达,减少CD8+T细胞的凋亡。研究证实,疏肝健脾中药对乳腺癌MDSC介导的免疫抑制功能有显著的下调作用,对控制肿瘤的生长和转移都有良好的作用。本研究主要探索疏肝健脾方在瘤前抑郁荷瘤模型(抑郁造模完成后接种4T1细胞)中对MDSC-NKT细胞的免疫调控功能的影响。1.研究目的通过临床研究,观察疏肝健脾方对门诊乳腺癌患者抑郁症状和中医临床症状的改善情况。通过基础研究,揭示疏肝健脾方对抑郁障碍型乳腺癌髓系抑制性细胞(MDSC)免疫抑制作用机制各个环节的影响,及对NKT细胞免疫功能重塑机制影响。从免疫抑制角度,揭示MDSC与NKT细胞在抑郁障碍型乳腺癌所诱导的免疫编辑过程的作用。为防治乳腺癌发生发展提供新的科学依据,同时也为中医学“情志学说”防治肿瘤增添新的理论基础,揭示中药防治肿瘤发展新的科学内涵。2.研究方法临床研究：采用SDS (Self-Rating Depression Scale)抑郁测评量表和中医证候量表,收录中国中医科学院广安门医院肿瘤科门诊53例乳腺癌患者,通过疏肝健脾方加减治疗两周,对比治疗前后量表评分变化。基础研究：BALB/c雌性小鼠抑郁造模28天后腋下接种4T1炎性乳腺癌细胞,建立瘤前抑郁障碍型乳腺癌小鼠模型,并完成对模型的评价；分别给予化疗药物吉西他滨、中药疏肝健脾方以及中西医结合进行干预。模型成功后采集海马、肿瘤、脾脏和外周血等,检测MDSC诱导的免疫抑制效应各环节指标。检测指标包括高效液相法检测海马中5-HT等神经递质；流式细胞技术检测MDSC及其亚型、NKT细胞、T细胞亚群；磁珠分选及流式技术检测小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细胞凋亡；ELISA检测小鼠外周血中IL-6. IL-4. IL-13、 IL-12、 IFN-γ、 TGF-β和VEGF；硝酸还原法检测小鼠脾脏NO和iNOS；磁珠分选小鼠脾脏MDSC及RT-PCR检测脾脏MDSC中JAK-STAT信号转导通路相关核转录因子。3.研究结果3.1临床研究结果显示,门诊乳腺癌患者伴随抑郁障碍的占67.92%,轻度抑郁占52.83%,中度抑郁占11.32%,重度抑郁占3.77%。经过疏肝健脾方治疗后乳腺癌患者伴随抑郁障碍的占56.6%,轻度抑郁占43.4%,中度抑郁占9.43%,重度抑郁占3.77%。治疗前SDS量表标准分小于53分患者,经两周治疗后标准分下降9例。治疗前标准分大于53分的患者在治疗后,标准分下降1-5分为17例,标准分下降6-10分5例,下降大于10分为0例。在接受疏肝解郁中药治疗后,患者中医临床症状普遍得到了缓解,中医证候量表评分下降也较为明显,下降主要集中在1-3分和4-6分两个水平段。3.2基础研究3.2.1高效液相法检测抑郁荷瘤模型海马5-HT等神经递质5-HT、5-HIAA和DA在海马中的表达均是中药组、化疗组、中西结合组明显高于抑郁荷瘤组,差异显著(p<0.05)；5-HT的表达是中药组高于化疗组、中西结合组(p<0.05)；5-HIAA表达中药组表达高于中西医结合组(p<0.05)；DA的表达中药组明显高于化疗组、中西结合组,具有显著差异(p<0.01)。说明抑郁荷瘤能降低5-HT等神经递质的表达,药物干预之后5-HT等表达升高,甚至高于正常组。3.2.2流式细胞技术检测脾脏MDSC及其亚型、NKT细胞、T细胞亚群全部荷瘤组MDSC表达均高于非荷瘤组(空白对照和单纯抑郁组),其中抑郁荷瘤组较正常小鼠MDSC含量高出接近1倍；化疗组、中西医结合组MDSC表达小于抑郁荷瘤组,且具有统计学意义(p<0.05)。抑郁荷瘤组NKT细胞表达低于中西结合组、单纯抑郁组和空白组,具有统计学意义(p<0.05),经过中西药物干预后NKT细胞表达升高。各组CD4+/CD8+匕值计算结果为：空白组的比值高于各组,未经干预的抑郁荷瘤组比值最低；中西医结合组比值大于抑郁荷瘤组(p<0.05)。说明抑郁和荷瘤状态能使MDSC表达升高,机体免疫抑制作用增加；经过药物干预之后能重塑NKT细胞的功能,有效拮抗了MDSC的免疫抑制效应,最终CD4+/CD8+比值上升,证实疏肝健脾方(或联合吉西他滨)能提高机体的免疫功能。3.2.3磁珠分选小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细胞及凋亡检测空白组CD8+T细胞早期凋亡率最低,为1.28%；抑郁荷瘤组早期凋亡率最高,为8.78%；三个治疗组中比较结果为中西医结合组<化疗组<中药组。空白组CD4+T细胞早期凋亡率最低,为2.91%；抑郁荷瘤组早期凋亡率最高,为7.33%；三个治疗组中,中西医结合组早期凋亡最少。证实,中西医结合组能在控制瘤体,改善抑郁状态的基础上,通过降低T细胞亚群的早期凋亡,从而降低MDSC的免疫抑制效应,提高机体的免疫功能。3.2.4小鼠外周血中MDSC相关细胞因子表达IL-6.IL-4.IL-13.IFN-γ、TGF-β和VEGF在MDSC诱导的免疫抑制效应中作为免疫负向调节的细胞因子,抑郁荷瘤组小鼠表达最高。经药物干预后的三个治疗组细胞因子表达均低于抑郁荷瘤组。IL-12在MDSC诱导的免疫抑制效应中正向调节免疫功能,抑郁荷瘤组表达最低,与化疗组、中药组和中西医结合组比较有统计学差异(p<0.05)。说明经过药物干预之后,IL-12表达上调,能有效的拮抗IL-13的表达,从而起到限制MDSC激活和扩增的作用,对免疫功能起到正向调节作用。3.2.5小鼠脾脏NO和iNOS表达检测NO和iNOS是MDSC的产物,iNOS可将T细胞合成所必须的精氨酸代谢为NO和瓜氨酸。体内氧自由基和NO结合的产物ONOO"能使T细胞内蛋白高硝基化,从而使CD+8T细胞反应性下降。化疗组、中药组、抑郁荷瘤组脾脏中NO表达明显高于空白组(p<0.05),抑郁荷瘤状态下小鼠MDSC表达同样高于空白组。给药干预之后,中药组、化疗组和中西医结合组NO表达低于抑郁荷瘤组,其中中西医结合组NO含量低于抑郁荷瘤组,具有统计学差异(p<0.05)。结果说明在化疗和疏肝健脾方治疗后,中西结合组MDSC表达下调,免疫抑制作用降低。化疗组、中药组与中西医结合组脾脏iNOS表达低于抑郁荷瘤组(p<0.05)。而本研究中iNOS表达趋势与MDSC在脾脏中表达的趋势相一致,经过药物干预后能下调这种免疫抑制的趋势,但是各个干预组之间没有统计学差异(p>0.05)。3.2.6磁珠分选小鼠脾脏MDSC及RT-PCR检测相关核转录因子与MDSC扩增关系最密切的通路是JAK-STAT通路。本研究通过磁珠分选技术,分选出小鼠脾脏MDSC,运用RT-PCT技术对信号通路中的相关因子进行mRNA含量检测。研究表明抑郁荷瘤组小鼠脾脏MDSC中的JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、 STAT6及Arg1、iNOS基因的表达最高,这与启动MDSC扩增的炎性因子上调相一致。经过药物干预之后,尤其是中西医结合干预之后能显著地下调JAK-STAT信号转导通路中的相关基因表达,单纯中药对各组基因表达下调程度不如单纯化疗和中西医结合,中西医结合干预之后,MDSC表达相关的基因下调最具有优势。4.结论临床研究显示,中药疏肝健脾方能改善乳腺癌患者的抑郁状态,但是改善主要体现在对轻度抑郁的调整和躯体症状的改善；治疗后中医肝郁脾虚证的临床症状得到了普遍的缓解。基础研究显示,抑郁和荷瘤状态能下调大脑5-HT等神经递质的表达,并且能分泌大量的炎性因子,高表达JAK-STAT信号通路中相关基因,包括JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT6,从而激活MDSC的扩增,启动免疫抑制功能。核转录信号因子SSTAT1、STAT3能增量调节下游精氨酸酶Ⅰ(Arg Ⅰ)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,在iNOS的催化作用下,Arg Ⅰ能产生大量NO,最终形成大量ONOO",能破坏CD8+T细胞免疫激活所必需的pMHC-TCR三元复合物的完整性和曲度,减少CD8+T细胞产生。并且使CD4+T和CD8+T细胞的早期凋亡增加,从而降低T细胞正常功能,破坏人体正常的免疫功能,最终促进肿瘤生长和转移。通过中西药物干预之后,能多靶点地作用于MDSC免疫抑制的各个环节,上调NKT表达并重塑其免疫功能,免疫负向调节因子IL一6.IL-4.IL-13.IFN-γ. TGF—β和VEGF下调,CD4+/CD8+比值上调,CD4+T和CD8+T细胞的早期凋亡率降低,从而达到提高免疫功能和抗肿瘤的作用。