【摘 要】
：
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）,别名绿脓杆菌,是一种自然界广泛分布的革兰氏阴性菌,也是一种最常见的条件致病菌,能引起肺炎、尿路感染以及败血症等多种急性感染,尤其对免疫力较弱的患者包括艾滋病患者、器官移植患者、大面积烧伤者、代谢性疾病患者均能引起感染,因此是医院获得性感染主要病原细菌之一。环二鸟苷酸（Cyclic diguanylate monophosphate,C-
论文部分内容阅读
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）,别名绿脓杆菌,是一种自然界广泛分布的革兰氏阴性菌,也是一种最常见的条件致病菌,能引起肺炎、尿路感染以及败血症等多种急性感染,尤其对免疫力较弱的患者包括艾滋病患者、器官移植患者、大面积烧伤者、代谢性疾病患者均能引起感染,因此是医院获得性感染主要病原细菌之一。环二鸟苷酸（Cyclic diguanylate monophosphate,C-di-GMP）是细菌胞内较为普遍的第二信使小分子,调控细菌诸多重要的生理功能及致病性,近十多年来,有关c-di-GMP信号传导分子机理已成为细菌致病机制的研究前沿,对于c-di-GMP代谢调控机制,设计新一代的抗菌药物已有报道进行总结。为此,以铜绿假单胞菌为研究对象,深入研究c-di-GMP代谢调控和受体感应机制,对于寻找新的药物靶点和研发新型抗菌药物具有重要的理论和实际意义。含PilZ结构域蛋白是c-di-GMP主要的受体蛋白,铜绿假单胞菌基因组编码8个含有PilZ结构域的蛋白,其中5个PilZ结构域蛋白功能已被鉴定,剩余3个功能未知包括PA2989。本研究以其中一个含有多结构域的PilZ蛋白PA2989为主要研究对象,通过对△PA2989的生物学表型及分泌的致病因子和致病性进行筛选与鉴定,并结合生物信息学找出其可能与c-di-GMP结合的氨基酸位点,最后通过RNA-seq转录组技术分析该蛋白可能影响细菌毒性的信号通路。主要研究结果如下:1、基于基因同源重组的原理获得△PA2989缺失突变体,通过对其突变体生物学表型、致病因子及其致病性进行筛选,发现PA2989基因缺失导致该菌群集运动能力增强、胞外多糖显著增多,菌落形态明显变皱;但是泳动能力、生物被膜、生长曲线均无显著性差异,说明PA2989基因可能与铜绿假单胞菌的急性感染有关,对致病毒性因子和宿主致病性的检测发现△PA2989缺失突变体分泌绿脓菌素和蛋白酶均无明显变化,但降低了对线虫的致死率和真核宿主细胞毒性,对植物宿主白菜的致病性反而增强,这可能与植物本身的免疫反应有关。2、通过对△PA2989基因进行互补,发现互补之后该菌的群集运动性、菌落形态等生物学表型均无法回补到野生型水平,这可能说明存在与PA2989互作的蛋白共同调控其重要的生物学功能。3、通过点突变PA2989蛋白中预测的PilZ结构域保守氨基酸位点,测定PA2989基因突变体和点突变荧光报告菌株的荧光强度,间接测定其胞内的c-di-GMP浓度,得出△PA2989菌株胞内的c-di-GMP水平较野生型相比显著升高,而点突变菌株PA2989R65AR69A并无明显变化,说明预测突变的氨基酸位点R65A、R69A可能并不是影响c-di-GMP结合的主要关键位点;构建PA2989和PA2989R65AR69A的蛋白标签整合菌株,利用pull-down技术验证PA2989R65AR69A氨基酸位点,得出其突变的位点可能影响PA2989蛋白与其他某种蛋白之间的互作,但这种蛋白目前还未知。4、通过RNA-seq数据分析并比较了突变体△PA2989与野生型PAO1菌株的基因谱表达情况,其差异表达基因显示有大量基因表达水平受到影响,其中差异较为显著且富集基因数目最多的是双组份系统,说明PA2989可能与某一未知蛋白互作参与由c-di-GMP介导调控双组份系统。本文的研究结果将为后期深入研究PA2989的代谢调控机制和受体感应机制提供依据,为研究新一代抗菌药物提供理论基础。
其他文献
荔枝是我国南方具有重要营养和经济价值的特色果树,严重的荔枝幼果脱落是荔枝产业亟需解决的关键问题之一。目前在荔枝上关于幼果脱落的分子机制研究较少。NAC是一类植物特有的转录因子,在果实成熟、叶片衰老、果荚开裂等过程中发挥重要作用。本课题组前期通过RNA-seq技术共挖掘了2730个与果实脱落相关的基因,其中包括了12条NAC转录因子。然而,NAC转录因子是否参与了荔枝果实脱落还需进一步的探讨。因此,
磷元素是植物必需的大量矿质营养元素,对于植物的生长发育有十分重要的作用。但土壤磷的有效性往往低于植物正常生长的需求。为了适应低磷胁迫,植物在长期的进化过程中形成了一系列的适应性机制,包括根形态构型的改变以及叶片花青素的累积等。大豆（Glycine max）是我国重要的粮油作物。土壤有效磷的缺乏显著限制大豆产量和品质的提高。我们前期通过对低磷胁迫下大豆根系c DNA酵母文库的筛选,鉴定到与蛋白磷酸酶
甜菜素是一种由L-酪氨酸衍生的水溶性含氮色素,可分为甜菜红素和甜菜黄素。甜菜素对植物形成红、紫、黄等颜色起着重要作用,其较高的营养价值、抗氧化活性和消炎能力对人类身体健康和疾病有着积极的影响。目前,甜菜素生物合成的途径还不清楚。本研究以有刺黄皮白肉火龙果（黄龙果）果皮三个发育关键时期（绿色果皮黑色种子、转色期和成熟期）为材料,利用转录组测序技术,筛选与甜菜素生物合成途径的候选基因,通过表达特性分析
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）是十字花科黑腐病的病原菌,其危害严重,因此迫切需要研发新型抗黑腐病药物。生物素是生物体内许多酶的辅因子,参与到多种代谢途径中,对生物的正常生长和生理活动至关重要。在病原菌中,生物素的合成与其致病力密切相关,因此生物素合成途径已成为一个极具潜力的新型抗菌药物的作用靶标。因此,本论文研究了野
根结线虫（Meloidogyne spp.）是农业生产上一类极具有破坏性的植物病原线虫,寄主广泛,每年可导致全球农作物产量大幅度降低。作物根结线虫病传统防治方法效果有限,为此,需要开发出新的防治作物根结线虫病技术。因根结线虫寄生多种植物,且自然界里抗根结线虫植物资源有限,所以推测根结线虫抑制寄主的防卫机制可能存在保守的信号通路。随着分子生物学技术的不断发展,人们很有可能揭示根结线虫抑制寄主防卫反应
香蕉（Musa spp.）是世界鲜果贸易量及消费量最大的水果之一,是继水稻、小麦、玉米之后的全球第四大粮食作物,但是香蕉枯萎病的大规模爆发和流行极大地限制了我国香蕉产业的发展。了解香蕉中香蕉枯萎病菌4号生理小种以及土壤相关微生物在不同土壤酸碱度和有机质中的动态变化,分析其各类变化的原因,已经成为急需解决的问题之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术,检测分析了不同酸碱度的土壤与不同有机质含量的土壤,
缨翅目昆虫通称蓟马,是一类具有重要经济意义的微小昆虫。广东省地处东洋界的热带亚热带地区,温暖潮湿的气候和复杂多样的自然条件,蕴育了广东省复杂的生态系统和丰富的动植物资源。因此,广东省缨翅目昆虫种类理应十分丰富,但广东省的蓟马种类记录大多数分散记载于国内外各种学术刊物、专著及标本馆中,其较准确的种类数及分布范围均尚未进行系统整理和调查。种类调查和区系分析是生物多样性保护及利用的前提,因此,本研究通过
MicroRNA（miRNA）是一类单链非编码的小分子RNA（s RNA）,在真核生物的生长、发育及各种抗逆应答中发挥重要作用。虽然真菌中已发现一类与动植物的miRNA非常相似的s RNA称为micro RNA-like RNA（milRNA）,但是有关其功能的研究,特别是与致病相关的研究报道非常有限。由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）引起的香
昆虫中肠是一个复杂的环境,不仅是昆虫消化的重要场所,也是昆虫防御细菌等病原物的第一道防线。粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）PS-1,是一类具有高效致病能力的革兰氏阴性菌,通过昆虫口器进入昆虫肠道,可感染甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）等多种农业害虫,但甜菜夜蛾中肠免疫PS-1的分子机制不清楚。为阐述甜菜夜蛾S.exigua中肠对PS-1免疫的分子机制,本研究在测
野生豆孢囊线虫（Heterodera sojae）于2016年最先在韩国被发现并报道。2016年本实验室在我国江西婺源发现该线虫,并鉴定了42个栽培大豆品种的抗性,然而,关于该线虫其它方面的研究未见报道。本论文以大豆和野生豆孢囊线虫为材料,探讨了大豆被野生豆孢囊线虫侵染后,植株根系中生理生化指标的变化,分析了野生豆孢囊线虫在不同抗性大豆根系内的生长发育、孵化及对寄主大豆生长的影响,同时也研究了不同