人胚胎植入是指从卵子受精到胚泡着床的一系列细胞或分子生物学事件,是一个极其复杂的生理过程,主要包括游离胚泡定位、黏附和侵入以及胎盘形成,是一个连续的动力生物学现象。研究表明,人早期妊娠过程实际上是在卵巢甾体激素的协同作用下,通过子宫和胚胎所表达的各种分子,在时间和空间上相互协同作用下完成的。作为侵入态的胚胎和接受态的子宫的同步发育是成功植入的关键或决定因素,也是胚胎植入调节的研究基础。从目前的动物以及人类的研究资料,胚胎植入受多基因调控,涉及到数以百计的分子,形成网络级联系统,这些分子之间可能有相互替代作用。作为侵入态的胚胎和接受态的子宫之间细胞因子、生长因子的动态平衡对于重建基质和控制侵入是很关键的,同时也是胚胎植入调节的研究基础。但是关于母胎界面这些分子的研究多局限于单个因子,而且有关外源性细胞因子以及激素对胚胎植入的调节作用以及细胞因子之间的相互作用的研究尚不多。本研究利用Luminex液相芯片技术,同时测定人测定人早孕绒毛外滋养细胞和蜕膜基质细胞两类细胞培养上清液中leptin、TGF-β1、IL-6、bFGF、IL-1ra、VEGF、EGF、IL-1α的八种蛋白的表达量,探索人体正常情况下的胚胎植入的细胞和分子生物学机理,试图寻找在人胚胎着床过程中同时起重要作用的多种关键性分子。IL-1β是胚胎着床必需因子之一,可能是母胎对话的第一启动因子,而且IL-1β作为一种重要的调节因子,通过与相应高亲和力受体结合随之引起第二波细胞因子的级联瀑布效应,还可以影响到人体内许多细胞因子的分泌。目前对IL-1β的调节作用多数是针对MMPs及其抑制剂。如何发挥其对母胎界面的HCG是胚胎最早产生的分子之一,而且是表明胚胎存在的最特殊的标志。在植入过程中通过旁分泌模式下的局部作用影响妊娠。有研究发现HCG对新血管发生的重要细胞因子VEGF的刺激作用具有显著性,并且HCG使得MMP-9显著增加,但是不影响TIMP-1,从而有助于滋养细胞的进一步侵入。目前关于HCG对胚胎植入的影响多数使用绒癌细胞株进行探讨,而用原代培养的滋养细胞和蜕膜细胞对其在早孕期的作用进行研究应该更有价值,但是少见文献报道。故分别用IL-1β和HCG作为调节剂,研究它们对上述母胎两类细胞分泌的上述八种细胞因子和生长因子的影响,以探索细胞因子和生长因子对滋养细胞侵袭、胚胎植入如何进行调控,寻找调控胚胎植入的细胞因子和生长因子网络的分子机制,为胚胎植入和妊娠建立提供更多的理论依据。第一部分人早孕期滋养细胞和蜕膜细胞表达的细胞因子及生长因子的差异【目的】研究人早孕期绒毛外细胞滋养层细胞和蜕膜基质细胞分泌的多种细胞因子和生长因子的表达,探讨这些细胞因子和生长因子在胚胎植入和妊娠建立过程中的作用。【方法】1.按孕周收集人正常早孕（6～9周）的绒毛和蜕膜标本,分别进行离体分离及培养。本实验分为用0.125%胰蛋白酶和15IU/ml DNA酶,温和消化绒毛组织;用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化蜕膜组织,用2.5%-1.25%BSA纯化绒毛外滋养层细胞和蜕膜基质细胞,去除成纤维细胞、巨噬细胞等。得到的绒毛外滋养层细胞（extravillous cytotrophoblasts,EVCT）和蜕膜基质细胞（decidualized stromal cells,DSC）,按5×10⁵/ml接种于分别铺在24孔培养板中1ml无血清培养液培养24h,鉴定其纯度在95%以上后,收集培养上清液。2.倒置显微镜下观察细胞生长状态。3.用SP免疫组化染色法鉴定细胞纯度将无菌盖玻片置于培养皿中进行细胞爬片培养,待细胞爬片基本长满时,取出盖玻片,PBS漂洗5min,3次,4%多聚甲醛4℃固定30 min,第一抗体分别为细胞角蛋白（CK7）和泌乳素（PRL）抗体,然后以链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶（streptavidin-peroxide,SP）染色法进行染色。加酶底物DAB、H₂O₂显色,光学显微镜观察,阳性细胞胞质呈棕黄色。操作按说明书进行,用PBS代替一抗做阴性对照。4.利用Luminex xMAP技术测定EVCT组和DSC组培养上清液中8种细胞因子和生长因子:IL-1α、IL-1ra、IL-6、VEGF、TGF-β1、Leptin、bFGF、EGF的蛋白表达量。比较这些细胞因子在人正常早孕期绒毛外细胞滋养细胞与蜕膜基质细胞中表达量的差异。5.用SPSS10.0软件进行统计学处理,独立样本t检验比较EVCT组和DSC组细胞因子和生长因子表达量的差异。显著水平P＜0.05。【结果】1.DSC及EVCT在24孔培养板正常生长,SP法免疫组化证实DSC的泌乳素（prolactin,PRL）表达阳性,细胞质内可见大量棕黄色颗粒;EVCT的角蛋白7（cytokeratin7,CK7）表达为阳性,细胞膜可见大量棕黄色颗粒。EVCT和DSC鉴定纯度均在95%以上,且生物学特性得以维持,可以用来实验。2.EVCT培养上清液中,占优势的细胞因子的含量由高到低依次是Leptin、TGF-β1、IL-6、bFGF、IL-1ra、VEGF、EGF、IL-1α。DSC培养上清液中,占优势的细胞因子的含量由高到低依次是Leptin、TGF-β1、bFGF、IL-1ra、L-6、EGF、IL-1α、VEGF。3.EVCT和DSC分泌的细胞因子和生长因子的蛋白表达量,两者之间除EGF外其他因子的表达经统计学处理有显著性差异。独立t检验结果显示:除EGF外,IL-1α、TIJ-1ra、IL-6、Leptin、VEGF、TGF-β1、bFGF差异均有统计学差异。【结论】人早孕期绒毛外滋养层细胞和蜕膜基质细胞分泌Leptin、IL-6、bFGF、IL-1ra、EGF、VEGF、IL-1α、TGF-β1可能通过自分泌和/或旁分泌的方式参与了早期胚胎植入和妊娠建立过程。母胎两类细胞中多种细胞因子和生长因子的表达水平不同,推测母胎之间通过这些因子进行对话,有利于细胞因子和生长因子的平衡,并在胚胎植入和妊娠建立过程中发挥了重要作用。第二部分重组人白介素1β对人早孕期滋养细胞和蜕膜细胞分泌的细胞因子及生长因子的调节作用【目的】研究重组人IL-1β对人早孕期绒毛外滋养层细胞和蜕膜基质细胞分泌的多种细胞因子和生长因子的影响,探讨其对这些因子的调节作用,以及对胚胎植入和胎盘形成的影响。【方法】1.DSC和EVCT的体外培养方法及鉴定方法同前,于第一次换液时用1ml含10ng/ml IL-1β的无血清培养液培养24h后收集上清液。2.倒置显微镜下观察细胞生长状态。3.用SP免疫组化染色法进行细胞纯度鉴定。（方法同第一部分3）4.利用Luminex xMAP技术测定培养上清液中8种细胞因子和生长因子TGF-β1、EGF、IL-1α、IL-1ra、IL-6、bFGF、VEGF、Leptin的蛋白表达量。比较人早孕期绒毛外滋养层细胞与蜕膜基质细胞表达的这些细胞因子在加入IL-1β前后蛋白表达量的变化。5.用SPSS10.0软件进行统计学处理,配对样本t检验比较EVCT组和DSC组加入IL-1β前后细胞因子和生长因子表达量的差异,显著水平P＜0.05。【结果】1.EVCT加入含调节因子IL-1β的培养液后收集的上清液,与EVCT空白组分泌的细胞因子和生长因子比较:IL-1α、Leptin、EGF表达量增加,而IL-1ra、IL-6、VEGF、TGF-β1、bFGF表达量减少。配对t检验结果显示:IL-1α、Leptin的增加具有统计学意义,IL-1ra、IL-6、TGF-β1、bFGF、VEGF的减少具有统计学意义。2.DSC加入含调节因子IL-1β培养液后收集的上清液,与DSC空白组分泌的细胞因子和生长因子比较:IL-1ra、Leptin表达量减少,而IL-1α、IL-6、VEGF、TGF-β1、bFGF、EGF表达量增加,其中IL-1ra、IL-6、bFGF、VEGF、Leptin的改变具有统计学意义。配对t检验结果显示:IL-1ra、Leptin的增加有统计学意义,IL-6、VEGF、TGF-β1、bFGF的减少均有统计学意义。【结论】IL-1β对人早孕期绒毛外细胞滋养细胞和蜕膜基质细胞分泌的多种细胞因子和生长因子表达的调节存在着差异,不同因子被上调、下调或无变化,提示在早孕期间母胎两类细胞的细胞因子和生长因子网络的错综复杂相互调节变化,可能有助于滋养细胞的浸润,子宫内膜的适度蜕膜化,母胎血管的形成,最终有利于胚胎植入和胎盘形成。第三部分人绒毛膜促性腺激素对对人早孕期滋养细胞和蜕膜细胞分泌的细胞因子及生长因子的调节作用【目的】研究人绒毛膜促性腺激素（HCG）对早孕期滋养层细胞和蜕膜基质细胞分泌的多种细胞因子和生长因子的影响,探讨其对胚胎植入和妊娠维持中的作用。【方法】1.收集人正常早孕绒毛和蜕膜标本,分别进行离体培养,鉴定其纯度在95%以上。（方法同第一部分1）于第一次换液时用1ml含25U/ml人绒毛膜促性腺激素的无血清培养液培养24h后收集上清液。2.倒置显微镜下观察各细胞生长状态,并拍照。3.用SP免疫组化染色法进行细胞纯度鉴定。（方法同第一部分3）4.利用Luminex xMAP技术测定培养上清液中8种细胞因子和生长因子TGF-β1、EGF、IL-1α、IL-1ra、IL-6、bFGF、VEGF、Leptin的蛋白表达量。比较人早孕期绒毛外细胞滋养层细胞与蜕膜基质细胞中这些细胞因子在加入HCG后表达量的变化。5.用SPSS10.0软件进行统计学处理,配对样本t检验比较EVCT组和DSC组加入HCG后细胞因子和生长因子表达量的差异,显著水平P＜0.05。【结果】1.用人绒毛膜促性腺激素处理后,滋养细胞中IL-1α、VEGF、EGF表达量增加,而IL-1ra、IL-6、TGF-β1、FGF、Leptin表达量减少,其中IL-1α、IL-1ra、IL-6、VEGF、TGF-β1、Leptin、FGF的改变具有统计学意义。配对t检验结果显示:IL-1α、VEGF、EGF的增加具有统计学意义,IL-1ra、IL-6、TGF-β1、Leptin、bFGF的减少具有统计学意义。2.用人绒毛膜促性腺激素处理后,蜕膜细胞中IL-1α、TGF-β1、Leptin、FGF表达量减少,而IL-1ra、IL-6、VEGF、EGF表达量增加,其中IL-1α、IL-1ra、IL-6、Leptin、FGF的改变具有统计学意义。配对t检验结果显示:IL-1α、Leptin、,bFGF、TGF-β1的增加具有统计学意义,IL-1ra、IL-6、VEGF、EGF的减少均有统计学意义。【结论】HCG通过旁分泌模式下的作用对母胎两类细胞分泌的多种细胞因子和生长因子的不同调节作用,提示其可能通过对这些因子的影响,从而对母胎血管的发生,滋养细胞侵入以及胎盘形成等方面起着重要作用,最终有利于胚胎植入和妊娠的维持。