1引言肾细胞癌（RCC）是泌尿系统中最常见的肾实质恶性肿瘤,占全球癌症的2.2%,其发病率呈上升趋势。RCC有多种组织学亚型,每种亚型都具有独特的分子特征,最常见的亚型是透明细胞型肾细胞癌（ccRCC）。研究人员发现ccRCC中经常出现表观遗传改变,这一过程施加的调控信息被称为“表观遗传学”,在其发生和进展过程中起着举足轻重的作用。其中一种机制是组蛋白的共价修饰。组蛋白甲基化修饰主要由组蛋白甲基转移酶调控。人类的基因组编码产生的赖氨酸的甲基转移酶可达50类,其中,能够编码含有SET结构域并在命名方式上相同的基因即属于同一个基因家族,主要包括SETD1A、SETD1B、SETD2、SETD3、SETD4、SETD5、SETD6、SETD7、SETD8、SETDB1和SETDB2。目前,该领域的研究明确了它们各自在不同肿瘤的发生进展中发挥着较为重要的作用,但是,关于它们在RCC中的表达水平及临床价值的研究较少,其在RCC中的研究价值尚未完全揭露。脂质异常积聚,往往形成肾周脂肪层,是ccRCC的显著特征之一。ccRCC的异常生长导致细胞代谢能力增强,各种代谢需求也相应地增加,异常累积的脂质便成为它们应对这种严苛条件不可或缺的重要物质。目前,关于脂质代谢在ccRCC中的具体分子机制尚不清楚。因此本研究将探索含SET结构域基因家族在RCC中的临床意义,并揭示脂质代谢在ccRCC中异常表达的深层机理及SETD8在此过程中扮演的重要角色。2含SET结构域基因家族在RCC中的临床意义研究方法:本研究运用GEPIA2数据库分析了含SET结构域基因家族的蛋白分子结构及所有基因mRNA的表达情况,并运用UALCAN数据库进行分析验证;本研究继续使用人类蛋白图谱数据库（HPA）分析了该家族基因转录翻译生成的蛋白在 RCC中的表达情况。另外,本研究还采用cBio Cancer Genomics Portal数据库能够可视化地呈现相关基因的改变,并观察基因突变地频率,综合性地分析单一样本的基因组改变和特定的生物学特性,如基因突变、纯合子缺失、基因扩增、mRNA的增加或减少等。最后,本研究结合Kaplan-Meierplotter生存分析数据库、OncoLnc生存分析网站和UALCAN数据库分析了 SETDs家族基因对于RCC患者总生存期的预后价值。研究结果:含SET结构域家族成员（SETDs）的蛋白结构中均含有SET结构域,这也是它们发挥功能的核心结构。与正常肾组织相比,SETD1A、SETD7、SETD8和SETDB1的mRNA在RCC中的表达水平明显增加;而SETD2、SETD3和SETDB2在肿瘤组织中的表达水平显著降低,SETD4和SETD5在两种组织中的表达量无明显变化。所有SETDs家族基因在RCC中存在多种突变类型,主要包括错义突变、扩增、深度缺失、mRNA或者蛋白表达水平增高、mRNA表达水平降低和多种突变融合,它们的突变频率为48%,即有约一半的RCC患者存在至少一个该家族的基因的一种或者多种突变。SETD8的高表达与患者较短的总生存期呈正相关,提示患者较差的预后;SETD3表达量较高的患者则具有较长的总生存期,提示患者较好的生存后果;其他家族基因对于患者总生存时间的长短不具有提示作用,无预后价值。总之,本研究认为SETD3和SETD8可能在RCC的进展中发挥了重要作用,可以提示RCC患者预后并为RCC的治疗提供新的策略,具有潜在的临床价值。3组蛋白甲基转移酶SETD8在ccRCC中的表达及临床意义研究方法:本研究利用UALCAN在线数据库分析了 SETD8在ccRCC中的表达情况及它与肿瘤分期和分级之间的相关性;通过运用TMA组织和收集的临床标本进行IHC和Western blot,进一步明确SETD8在ccRCC组织中的表达水平;通过使用Kaplan-Meier plotter生存分析数据库和TMA患者生存资料,分析SETD8的表达水平与患者总生存期之间的相关性。本研究继续采用CCK-8、Transwell、WB、qPCR和克隆形成等实验检测SETD8的表达缺失对ccRCC细胞系增殖、迁移侵袭等生物学功能的影响。另外,本研究还通过构建sh-SETD8的稳转细胞系并以皮下异体种植的方式模拟体内肿瘤发生,验证SETD8对于ccRCC细胞系在体内生长的影响。研究结果:SETD8在ccRCC组织中的mRNA表达水平明显高于其在毗邻正常组织中的表达水平,而且SETD8的mRNA在ccRCC中的高表达与肿瘤的高分级和高分期呈正相关;癌组织中SETD8的表达量越高,提示患者后期的结果越差,是ccRCC患者预后的独立预测因子。另外,基因沉默和分子抑制剂降低SETD8的表达量能够有效地减弱ccRCC细胞的增殖、克隆形成能力,以及肿瘤细胞的迁移、侵袭能力。最后,肿瘤异种移植模型（CDX模型）的实验结果显示SETD8的基因沉默确实能够明显地减缓ccRCC细胞在体内成瘤的发生和进展。4 SETD8通过直接调控SREBP1介导的脂质代谢通路促进ccRCC的进展转移研究方法:本研究通过对RNA-seq测序数据进行GSEA生信分析,明确SETD8在ccRCC细胞中调控的功能通路;通过进行基因之间的相关性分析、qPCR和Western blot实验,本研究探究了 SETD8分别与脂质代谢通路中三个关键限速酶（ACACA、FASN和SCD1）和转录因子SREBF1之间的关系;通过ChIP-qPCR实验,本研究揭示了 SETD8调控SREBF1的具体分子机制。本研究还通过进行CCK-8、克隆形成实验、Transwell、WB、ORO实验和拯救实验验证了 SETD8通过调节SREBP1的表达对ccRCC细胞在增殖、单克隆扩增和迁移侵袭等表型功能方面的影响。通过运用GEPIA2数据库的生信分析功能及进行IHC实验,本研究进一步明确了 SETD8和SREBF1分别与ACACA、FASN和SCD1之间的相关性。最后,通过进行qPCR、WB和IP实验,本研究验证了 USP17对SETD8表达的调控机制。研究结果:GSEA分析结果表明SETD8参与调控脂质生成通路,SETD8沉默可同时降低三种关键酶ACACA、FASN和SCD1的表达;Spearman相关性分析表明SETD8和SREBF1的mRNA丰度之间呈正相关性,SETD8缺失或过表达可以导致SREBP1表达的减少或增加;ChIP-qPCR结果表明SETD8能够通过介导H4K20mel信号的强弱改变SREBF1启动子区域的染色质模式,从而直接激活后者的基因转录。拯救实验结果显示SETD8通过激活SREBP1的表达促进ccRCC的脂质生成,加速细胞的生长和转移。GEPIA2生信分析显示SETD8和SREBF1分别与三种关键酶均呈正相关性;肿瘤异体移植瘤的IHC实验结果验证了 SETD8对于这些关键酶表达情况的影响,并且降低了肿瘤组织中KI67的表达,SETD8使得ccRCC细胞在体内的增殖受损。IP实验证实USP17介导的去泛素化作用在翻译后稳定SETD8蛋白,使后者在ccRCC中维持高表达;而且USP17通过影响SETD8的表达调控脂质代谢通路,进而促进ccRCC的进展转移。结论:1.SETD3和SETD8可能在RCC的进展中发挥了重要作用,能够提示RCC患者的生存后果,并为RCC的治疗提供新的策略,具有潜在的临床价值。2.SETD8在ccRCC中高表达,是ccRCC患者预后不良的预测因子。3.SETD8能够通过介导的H4K20me1信号直接影响SREBP1调控的脂质代谢通路,从而促进ccRCC的进展转移。意义:本研究通过进行生信分析揭示了 SETDs基因家族在RCC中的表达和突变情况,并分析了每个基因在患者预后方面的临床应用价值,推测出SETD3和SETD8可能是RCC的潜在分子标记物;通过一系列的细胞功能实验、体内成瘤实验,本研究明确了 SETD8在ccRCC中的临床意义,以及USP17/SETD8/SREBP1通路在ccRCC脂质代谢和进展转移方面发挥的至关重要的作用。