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目的:耐药细菌感染已成为临床抗感染治疗中极为棘手的问题,是造成重症感染死亡的首要原因,尤其是多重耐药、全耐药的超级细菌感染,临床可选的抗菌药物十分有限。更令人担忧的是,耐药菌株的出现速度已经远远超过了新抗菌药物的研发速度。因此,寻找和研制对抗耐药细菌的新策略和新药物,已成为当今世界各国医学科学家当务之急的研究课题。抗菌药物的经典研究思路是以细菌蛋白为靶点,而反义抗菌策略则是以细菌内致病、耐药、生存等关键基因为靶点,采用反义小核酸分子阻断这些基因的表达,从而达到抑制或者杀灭细菌的作用。与经典的抗菌药物相比,反义抗菌分子具有靶标基因明确、药物分子设计容易、特异性强、不易诱导耐药、能够快速规模化制备、研发周期短等优点。因而反义抗菌策略被认为是抗耐药菌感染最有希望的突破口。采用反义抗菌策略,我们实验室在前期研究中发现了多个细菌靶标基因,筛选出多个反义抗菌分子,并在离体和感染动物模型上证实了这些反义抗菌分子能够有效阻断细菌基因,从达起到逆转细菌耐药性、抑制或杀灭细菌的作用。然而,反义核酸是一类亲水性强,分子量大,荷负电荷的分子,祼的反义核酸分子很难穿透细菌胞膜进入细菌细胞内,这已成为制约反义抗菌药物进一步开发研究的瓶颈。因此,研制高效向细菌内递送小核酸药物的递送系统,是反义抗菌药物研究领域重要的课题,也是实现反义抗菌药物向临床应用过渡必须突破的难点。理想的反义抗菌分子递送载体应当能安全高效的将反义抗菌分子递送至细菌内,使其选择性阻断细菌靶基因的表达而发挥抗菌作用。已有文献研究表明,透膜肽能够通过共价偶联的方式将小核酸分子递送至细菌内发挥抗菌作用,但这种策略受载药量低、连接臂设计及合成困难等因素的限制而难以推广。有文献报道,与线性结构的多肽相比,分枝状多肽因具有广阔的分子内腔结构,更有利于小核酸分子的包裹和递送。然而分枝状多肽能否与反义抗菌分子以非共价方式形成纳米粒从而实现细菌内递药,目前尚无研究报道。回答上述问题至少应该明确:(1)哪些因素影响分枝状多肽/小核酸药物纳米粒的形成?(2)分枝状多肽中哪些因素与纳米粒在细菌递送效率直接相关?(3)细菌细胞和哺乳动物细胞对纳米粒的摄取机制有何不同?(4)不同的细菌如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或者敏感菌与耐药菌对纳米粒的摄取特点是否不同?本课题针对上述未知领域,以含有四个末端分支的多肽为基本结构,以亮氨酸-色氨酸-精氨酸为基本重复序列,考虑电荷数目及分布、亲水与疏水、羟基氨基酸、组氨酸及脂质辅助成分等影响因素,设计七条分支状多肽(Dendritic Poly-peptide,DPP),以第一代反义核酸分子硫代反义寡核苷酸(PS-ODN)为模型药物,系统研究分枝状肽-反义核酸分子纳米粒(ODN/DPP纳米粒)的制备及其影响因素,深入探讨纳米粒细菌内递药特性及可能的递送机制,为反义抗菌技术的发展提供新的依据。方法:1.DPP的设计与合成我们共设计了七条分枝状多肽,命名为DPP1-7。重点考察以下因素对纳米粒制备和细菌内递药的影响:(1)亲水性与两亲性:DPP1,DPP4,DPP5和DPP6为亲水性DPP,而DPP2,DPP3,DPP7为两亲性DPP;(2)电荷分布:在DPP1和DPP6分枝中,正电荷分布分别呈两端分布和平均分布,在DPP2疏水分枝和亲水分枝中,电荷分布呈一疏一密,而DPP3中电荷集中分布在亲水枝。(3)羟基氨基酸:DPP1和DPP6中含有亮氨酸和色氨酸,而在DPP4和DPP5中用含有羟基的丝氨酸和苏氨酸代替。(4)组氨酸:DPP7中用组氨酸来替换DPP3中亲水端中的赖氨酸。DPP采用十二通道半自动多肽合成仪合成,并通过LC-3000高效液相色谱仪纯化,API-150EX质谱仪测定DPP分子量。2.ODN/DPP纳米粒的制备与表征将DPP与PS-ODN按不同氮磷比充分混匀,在37°C孵育,使DPP与PS-ODN通过静电作用形成ODN/DPP纳米粒。然后用凝胶电泳检测,筛选出最佳N:P比,按最佳N:P比制备纳米粒并表征。表征主要分三部分,一是用透射电镜观察ODN/DPP纳米粒的形态,二是用DLS测量纳米粒粒径和zeta电势,三是用荧光分光光度法定量ODN/DPP的包封率。3.ODN/DPP纳米粒形成的影响因素及稳定性用不同浓度的磷酸盐缓冲液和不同p H值的磷酸盐缓冲液为溶剂制备ODN/DPP纳米粒,并比较不同条件下所制备的纳米粒粒径;用圆二色谱法测量不同溶剂中DPP的二级结构,探索溶剂影响纳米粒形成的原因;其次采用两步法制备ODN/DPP/DOTAP纳米粒,并通过DLS比较与ODN/DPP纳米粒粒径的大小,评价脂质辅助剂DOTAP对纳米粒粒径的影响。将制备好的纳米粒存储于4°C,每隔一周用DLS测定其粒径变化,连续测四周,以评价其时间稳定性。4.ODN/DPP纳米粒对PS-ODN的递送效率及特征实验菌株选用产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌(ESBLs-EC)、敏感型大肠埃希菌(EC)、产超广谱内β-酰胺酶肺炎克雷伯杆菌(ESBLs-KP)、鼠伤寒沙门杆菌(ST)四株革兰氏阴性菌,和金黄色葡萄球菌(SA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)、粪肠球菌(EF)四株革兰氏阳性菌。用FITC-labeled PS-ODN与DPP制备纳米粒,与细菌在37°C避光共孵育一定时间,然后用流式细胞仪检测细菌阳性率,评价不同ODN/DPP纳米粒在不同细菌内的递送能力和递送速率。5.ODN/DPP和ODN/DPP/DOTAP纳米粒对细菌靶基因表达和细菌生长的抑制实验菌株选用ESBLs-EC。采用RT-PCR法检测anti-rpo D ODN/DPP和anti-rpo D ODN/DPP/DOTAP纳米粒对ESBLs-EC靶基因rpo D表达的影响,通过生长曲线测定ODN/DPP/DOTAP纳米粒对细菌生长的抑制,确定anti-rpo D ODN/DPP和anti-rpo D ODN/DPP/DOTAP纳米粒能否将PS-ODN有效的递送进细菌内并发挥抗菌作用。6.ODN/DPP/DOTAP纳米粒组分功能分析和纳米粒的细菌摄取机制探讨制备FITC-labeled ODN/DPP2纳米粒、ODN/DPP2/DOTAP纳米粒和ODN/DOTAP纳米粒,并通过流式细胞仪分别检测纳米粒在ESBLS-EC和MRSA内的递送效率,结合RT-PCR和生长曲线的结果,分析纳米粒中各组分的功能;将FITC-labeled ODN/DPP纳米粒与细菌分别在4°C和37°C共孵育后用流式细胞仪检测细菌阳性率,探索ODN/DPP纳米粒的细菌内递送是否为能量依赖性过程;将细菌用哺乳细胞内吞抑制剂处理后,再与FITC-labeled ODN/DPP纳米粒避光共孵育,并检测细菌阳性率,以探索ODN/DPP纳米粒的细菌内摄取机制。结果:1.ODN/DPP纳米粒制备及形态表征通过凝胶电泳,得到ODN/DPP纳米粒制备的最佳氮磷比为8;TEM观察结果显示氮磷比为8时,ODN/DPP纳米粒呈球形,粒径约45~80 nm;DLS测量结果显示,ODN/DPP纳米粒zeta电势<5 m V,PDI<0.3,分布均一;含有羟基氨基酸的DPP4和DPP5不能与PS-ODN形成稳定纳米粒;亲水性与两亲性、电荷分布和组氨酸都对ODN/DPP纳米粒形成没有影响;ODN/DPP纳米粒对PS-ODN的包封率在80%以上。2.ODN/DPP纳米粒粒径的影响因素与稳定性溶剂中磷酸盐浓度对ODN/DPP纳米粒的制备具有显著影响,溶剂中离子浓度的升高会导致纳米粒粒径急剧增大;除ODN/DPP2以外,溶剂p H值对的ODN/DPP纳米粒的形成过程没有明显影响;圆二色谱法分析结果显示,当盐溶液浓度超过20m M时,DPP的二级结构发生明显变化;在p H为5.5的酸性溶剂中,DPP2的二级结构也发生变化。辅助剂DOTAP对纳米粒粒径没有影响;稳定性研究结果显示,所制备的纳米粒在4°C可稳定保存2周。3.ODN/DPP纳米粒递送效率及特征与亲水性DPP1,DPP4,DPP5和DPP6所制备的纳米粒共孵育后,待测菌阳性率不足50%,而与两亲性DPP2,DPP3和DPP7纳米粒共孵育后,细菌阳性率多在90%以上;两亲性ODN/DPP纳米粒在ESBLS-EC内的递送过程很快,孵育5至10min细菌阳性率即达到最高,但在MRSA菌株上,其递送过程较慢,孵育30 min后才达到最高细菌阳性率。4.ODN/DPP和ODN/DPP/DOTAP纳米粒对靶基因表达和细菌生长的抑制1μM的两亲性anti-rpo D ODN/DPP和ODN/DPP/DOTAP纳米粒都能有效抑制ESBLS-EC rpo D基因的表达,并能有效延迟细菌的生长,而且ODN/DPP/DOTAP纳米粒的效率更高。5.ODN/DPP/DOTAP纳米粒组分功能分析和纳米粒的透膜机制探讨流式细胞仪检测结果提示,ODN/DPP2/DOTAP和ODN/DPP2纳米粒的细菌内递送效率没有显著性差异,而ODN/DOTAP不能有效进入菌内,说明纳米粒中DPP主要发挥透膜作用,而DOTAP并不影响透膜过程;细菌与ODN/DPP纳米粒在不同温度孵育后,阳性率没有显著差别,提示ODN/DPP纳米粒菌内递送过程是非能量依赖的;网格蛋白介导胞吞抑制剂氯丙嗪能够抑制ODN/DPP纳米粒在革兰氏阳性菌内的递送,而巨胞饮介导内吞抑制剂阿米洛利和小窝蛋白介导胞吞抑制剂染料木素则无影响;三种胞吞抑制剂对ODN/DPP纳米粒在革兰氏阴性菌上内的递送效率无影响。结论:1.氮磷比为8时,可制备得到包封率高、稳定性好,粒径为45~80 nm的球形ODN/DPP纳米粒,其制备影响因素研究表明:溶剂盐离子浓度能显著增高纳米粒粒径,是影响ODN/DPP纳米粒制备的关键因素。2.两亲性DPP2,DPP3,DPP7制备的纳米粒在实验所测八株菌中均有良好的递送效率,在DOTAP存在条件下,能显著抑制细菌靶基因的表达和延迟细菌的生长。3.革兰氏阴性菌和阳性菌对两亲性ODN/DPP纳米粒存在不同的摄取机制。4.证实脂质DOTAP能显著提高两亲性ODN/DPP纳米对靶基因抑制效果。5.两亲性ODN/DPP/DOTAP纳米粒是一类具有潜在应用价值和前景的反义抗菌分子递药系统。