研究背景人体拥有一个非常复杂的共生微生物群落,它们定殖在肠道、泌尿生殖道、呼吸道和其他屏障组织中,参与机体的发育以及人体生理功能的形成和维护,维持体内稳态,被称作人体的另外一个器官。肠道拥有人体内数量最多、构成最复杂的微生物群落。研究表明,肠道菌群在人体能量摄入、营养支持、代谢平衡、炎症、神经激素反应、免疫系统发育和免疫调节中起着重要作用。慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)是指由各种原因引起的肾脏结构或功能异常大于等于3个月的慢性进行性肾损伤。当慢性肾脏病不断进展,引起肾小球滤过率下降及与此相关的代谢紊乱和临床症状综合症则为慢性肾衰竭(Chronic Renal Failure,CRF)。由于不能被肾脏完全排泄,许多代谢废物如尿素、肌苷等积聚在慢性肾脏病患者体内。这些代谢废物通过肠壁血管进入肠腔,引起肠道生化环境的改变,从而导致肠道微生物菌群结构和功能发生变化。有研究证实,肠道微生物菌群结构和功能的改变以及肠道屏障结构、功能的破坏会导致人体对某些有毒副产物的产生和吸收,这些有毒副产物界易引起尿毒症毒性、炎症、营养不良以及与尿毒症相关的其他疾病。二代测序等高通量分子生物学技术的发展,为我们利用基因组学的方法研究肠道菌群的结构和功能提供了非常好的技术支持。越来越多的研究表明,肠道微生态不仅与肠道疾病密切相关,而且与肥胖、肿瘤、糖尿病、自闭症、慢性肾脏病等多个系统的多种疾病的发生发展关系密切。目前,尚无研究详细探索慢性肾脏病进展不同阶段患者肠道菌群的变化以及哪些肠道微生物菌群更适合作为生物标记物用于慢性肾脏病的无创诊断和治疗。粪菌移植(Fecal Microbiota Transplantation,FMT)是指对健康人粪便进行标准化处理,然后将获得的功能菌群移植到菌群失调的患者胃肠道内,重建患者肠道菌群,以达到治疗疾病的目的。目前,已经有研究将FMT应用于胃肠道疾病、血液病、神经精神性疾病、慢性乙型肝炎、代谢综合征、耐药菌感染等多种疾病的治疗。2013年,FMT被写入美国的临床指南,用于治疗复发性难辨梭状芽孢杆菌感染。FMT的临床疗效已经在很多疾病中得到验证,但FMT对慢性肾衰的治疗尚无研究。综上研究背景和理论基础,我们设计并进行了本次研究。本研究主要包括两部分:(1)通过基于16S rRNA的高通量测序,研究慢性肾脏病患者病情进展中肠道菌群的变化,以期找出与慢性肾脏病病情发生发展相关的菌群,并进一步探索与慢性肾脏病相关的生物标志物。(2)采用腺嘌呤灌胃的方法建立慢性肾衰小鼠模型,然后对正常小鼠的粪便进行处理后给模型小鼠进行粪菌灌肠,研究FMT对慢性肾衰小鼠的影响,并筛选与粪菌移植相关的炎症细胞因子及相关的信号通路。研究目的本课题拟利用分子生物学方法和动物实验探索慢性肾脏病进展中肠道菌群的改变,识别与慢性肾脏病相关的标志性菌属,探索FMT对慢性肾衰的治疗效果,筛选FMT治疗慢性肾衰过程中参与的炎症细胞因子和相关的信号通路,为进一步研究粪菌移植对慢性肾衰的影响机制以及通过调节肠道菌群治疗慢性肾衰提供理论基础。研究方法1.招募慢性肾脏病患者和健康志愿者,收集入组者新鲜粪便标本,使用试剂盒提取粪便基因组DNA,对其16S rDNA的V3-V4区进行扩增,并应用Illumina Miseq平台测序。2.使用物种组成分析、主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、线性判别分析效应尺寸(LEfSe)分析等多种生物信息分析方法来比较慢性肾脏病患者和正常人群肠道菌群的差异。3.应用LEfSe分析比较慢性肾脏病进展不同阶段患者与正常人群肠道菌群的差异以及慢性肾脏病不同分期患者之间肠道菌群的差异。4.制作受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲线鉴别慢性肾脏病患者和正常人群差异肠道菌属中最好的生物标志物。5.使用EXCLE筛选高通量测序的所有数据,寻找与慢性肾脏病进展及血液透析相关的生物标志物。6.采用腺嘌呤灌胃的方法建立慢性肾衰小鼠模型。7.对正常小鼠粪便进行处理后给模型小鼠进行粪菌灌肠,收集正常组、肾衰对照组和粪菌移植组小鼠的粪便进行高通量测序,比较正常组、肾衰对照组和粪菌移植组小鼠肠道菌群的差异。8.收集正常组、肾衰对照组和粪菌移植组小鼠的血清,通过生化仪器检测FMT对慢性肾衰小鼠生化指标的影响。9.剪取正常组、肾衰对照组和粪菌移植组肾脏和结肠,HE染色研究FMT后小鼠肾脏和结肠的病理改变。10.收集肾衰对照组和粪菌移植组小鼠的血清进行芯片实验,通过数据分析软件、差异基因基因本体(GO)富集分析、差异基因京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析等分析方法研究FMT对炎性细胞因子的影响及相关的信号通路。研究结果1.慢性肾脏病患者和健康人群的肠道菌群结构存在差异:与健康对照组(Healthy Controls,HC)相比,CKD组肠道菌群分布发生了显著变化,硬壁菌门(Firmicutes)占比明显降低(P<0.001),拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)占比显著增加(P=0.002,P=0.03)。2.CKD组和HC组相比,两组中有49个菌有显著差异;慢性肾脏病非透析组(CKD-NonHD)和HC组相比,两组中有45个菌有显著差异;慢性肾脏病透析组(CKD-HD)和HC组相比,两组中有70个菌有显著差异;CKD-NonHD组和CKD-HD组相比,两组中有26个菌有显著差异;CKD-NonHD组中2期、3期、4期之间有13个菌有显著差异。3.HC组线性判别分析(Linear Discriminant Analysis,LDA)分值最高的5个菌属中,Lachnospira的曲线下面积最大(AUC=0.813;95%CI:0.713～0.912;P<0.001),CKD组LDA分值最高的5个菌属中,Ruminococcus_gnavus的曲线下面积最大(AUC=0.813;95%CI:0.713-0.912;P<0.001)。4.在属水平上,Holdemanella,Megamonas 和Prevotella2 没有在 CKD-HD 组的粪便样本中检测到;Dielma和Scardovia未在HC组的粪便样本中检测到。5.FMT对慢性肾衰小鼠肠道菌群的影响:与正常组小鼠相比,慢性肾衰小鼠肠道菌群分布发生了显著变化,硬壁菌门占比显著降低(P=0.007),拟杆菌门占比显著增加(P<0.001);对慢性肾衰小鼠进行FMT后,FMT组小鼠肠道菌群得到了恢复,与肾衰对照组小鼠相比,硬壁菌门占比显著增加(P<0.001),拟杆菌门占比显著降低(P<0.001)。6.FMT对慢性肾衰小鼠生化指标的影响:与正常组小鼠相比,肾衰对照组和粪菌移植组小鼠的尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)水平显著增高(PAB=0.001,PAC=0.001);与肾衰对照组相比,粪菌移植组小鼠的BUN水平没有明显改变(PBc=0.937)。小鼠血清肌酐(SCr)水平呈现出与BUN相同的趋势:正常组分别与肾衰对照组和粪菌移植组差异显著(PAB<0.001,PAC＜0.001);粪菌移植组SCr水平比肾衰对照组有所降低,但这种差异没有统计学意义(PBC=0.185)。7.FMT对慢性肾衰小鼠病理的影响:(1)小鼠肾脏组织病理学改变:肾衰对照组小鼠肾脏病变明显,部分肾小球毛细血管扩张;肾小管病变表现为:肾小管上皮细胞水泡变性,胞浆疏松、淡染,甚至胞浆出现空泡,肾小管管腔明显出现扩张,管腔内明显可见沉积物和细胞碎片;肾间质内轻度纤维组织增生,可见少量炎性细胞浸润。粪菌移植组小鼠病变为部分肾小球毛细血管扩张,部分肾小球囊上皮细胞轻度增生;肾小管病变表现为轻度肾小管上皮细胞水泡变性,胞浆疏松、淡染,肾小管管腔明显出现扩张,管腔内明显可见沉积物和细胞碎片;肾间质内轻度纤维组织增生,可见少量炎性细胞浸润。(2)小鼠结肠组织病理学改变:肾衰对照组小鼠黏膜下层疏松水肿,间隙增大,有单核细胞和中性粒细胞分布;肠黏膜底部可见炎性细胞浸润,局灶性肠黏膜坏死,纤维组织增生。粪菌移植组小鼠黏膜下层疏松水肿,间隙增大;肠黏膜底部可见炎性细胞浸润,局灶性肠黏膜坏死,纤维组织增生。8.MIP-1 alpha、IL-13、SDF-1、KC、GCSF、BLC、Eotaxin-2、Lymphotactin及LIX九个炎症细胞因子在粪菌移植组中高表达,Leptin,I-TAC两个炎症细胞因子在粪菌移植组中低表达。9.粪菌移植组和肾衰对照组差异炎症因子基因显著富集的通路有:Cytokine-cytokine receptor interaction,Chemokine signaling pathway,IL-17 signaling pathway,Rheumatoid arthritis,Jak-STAT signaling pathway,Salmonella infection 和 Toll-like receptor signaling pathway。研究结论1.与健康人群相比慢性肾脏病患者肠道菌群结构发生了改变。2.CKD进展不同阶段患者与正常人群肠道的差异细菌不同,CKD-HD组有更多的差异细菌;CKD不同分期患者之间肠道菌群存在差异。3.Lachnospira和Ruminococcus_gnavus是区分慢性肾脏病患者和健康人群较好的生物标志物,需要进一步开展大规模前瞻性研究和对照研究,以探索其可靠性和实用性。4.FMT改变了慢性肾衰小鼠的肠道菌群,但没有显著改善慢性肾衰小鼠的BUN和SCr水平。5.筛选出粪菌移植组与肾衰对照组小鼠的差异炎症因子及其差异基因显著富集的通路,为进一步研究粪菌移植对慢性肾衰的影响机制提供理论基础。