研究背景　　 先天性心脏病是常见的出生缺陷之一,可导致围产期25％～35％的死亡率。心脏形成是胚胎发育的早期事件,它涉及胚胎发育过程中不同时间、不同空间若干个基因的先后表达及精确的相互作用,也涉及细胞的迁移、分化和增殖。目前认为先天性心脏病是由于遗传因素和环境因素共同作用于心脏发育环节,导致一些相关基因在时间和空间上的表达异常所致。在先天性心血管畸形中,瓣膜发育异常占20-30％。　　 心脏房室瓣的发育起源于心脏环化后心管的房室沟和流出道处心内膜垫形成。在心肌信号因子的转导作用下,上皮细胞向间充质细胞转化并移行至心脏胶冻层形成心内膜垫。随着心内膜垫逐渐发育为成熟的瓣膜结构,瓣膜的间质细胞趋向于增生减弱,定居在瓣膜的特定区域,分化程度高。瓣膜的细胞外基质也趋于高度组织化。在电镜下可见瓣叶的细胞外基质分三层:纤维层、海绵层、心房层,依次沿血流方向平行排列。Tenascin是一种粘蛋白,也是腱索的“经典"标记物,主要在纤维层和腱束表达。Aggrecan是一种蛋白聚糖,主要在海绵层表达。细胞外基质在心脏瓣膜的有机构成,使瓣膜各层具有不同特性,维持着心脏瓣膜在整个心动周期的协调运动和完整功能。特异性的基质蛋白不但在瓣膜发育阶段参与其重要的分层过程,而且这一作用可持续至出生后。细胞外基质空间发育和瓣膜间质细胞分化的不协调均可导致瓣膜发育异常。　　 先天性房室间隔缺损(Atrioventricular septal defect,AVSD)是一种比较常见的先天性心脏病,在所有人类已认识的先天性心脏病中占7～8％。AVSD在21-三体综合征表现出密集的发病。由于该病早期即可出现心功能不全和不可逆的肺动脉高压,未经治疗的患儿大多数在5岁内死亡。　　 目前已经发现2个与AVSD发病有关的位点:AVSD1和AVSD2,其中AVSD1(OMIM606215)位于染色体1p31～1921,但尚未发现其对应的基因；AVSD2(OMIM606217)位于染色体3p25,对应的基因是CRELD1(Cysteine-rich with EGF-like domain1)。CRELD1属于表皮生长因子样家族,编码一种细胞表面蛋白,功能上类似细胞粘附分子。　　 本研究对AVSD病例,进行CRELD1基因的测序,并对突变基因进行功能分析,以探讨CRELD1基因突变在AVSD形成中的意义。　　 研究方法　　 1.PCR扩增所有AVSD病例CRELD1基因的全部11个外显子及两侧各50个碱基以上的序列,测序。测序结果与人类CRELD1基因组序列比较。　　 2.以含CRELD1基因的pOTB7质粒DNA序列为模板,针对CRELD1的突变序列设计相应的引物设计突变引物序列。　　 3.构建真核表达载体pcDNA3.1-CRELD1,转染胚胎肺成纤维细胞HFL-Ⅰ,Western-Blot检测CRELD1、Tenascin-C、Aggrecan蛋白表达水平,实时荧光定量RT-PCR检测CRELD1、Tenascin-C和Aggrecan mRNA表达水平。　　 研究结果　　 1例女性患者C857G碱基变化,使位于外显子8上第一钙结合EGF区域286位点丙氨酸替代了脯氨酸。患者系部分性房室间隔缺损,非21-三体综合征。在150名正常人群中未发现相同位点的碱基变化。三维结构重建显示蛋白质的空间位置发生改变。该位点的碱基变化遗传自其母亲,但体格检查和超声心动图检查显示其母亲心脏结构和功能正常。　　 8例患者中外显子4发现C383G碱基变化,该碱基变化使位于WE结构域第128位点的精氨酸代替脯氨酸,该碱基变化为多态性(rs2302787)。5例患者外显子10上T1136C变化使位于Ⅲ型跨膜域379位点的苏氨酸替代蛋氨酸。对150名正常人群进行了该位点的检测,结果有7人存在该碱基变化,故为一新发现的单核苷酸多态性。15例在外显子10发现一不影响氨基酸编码的同义突变C1119T(rs3774207)。　　 Western-blot和实时荧光定量RT-CR检测结果显示,CRELD1基因P286A突变后,基因的功能增强,即表现为“过表达”。应用2(-△△C他)计算目标基因的相对表达量,可见与空载对照相比,野生型和突变型Aggrecan的mRNA表达均下调(t值分别140.27,26.36,P<0.01),但突变型与野生型之间的Aggrecan表达也存在显著差异,突变型下调更为明显(t=-25.69,P=0.002)。Tenascin-C在野生型和空载组的表达无明显差异(t=1.167,P>0.05),但突变型的Tenascin-C表达明显增强(t=6.66,P=0.022)。　　 结论　　 1.CRELD1基因错义突变是AVSD发病的高风险易感因素。但其突变率低,且突变基因携带者可表型正常,故AVSD可能是遗传因素和环境因素共同作用的产物；或者是存在多个突变基因高突变率的单基因遗传性疾病。　　 2.CRELD1基因P286A突变可使基因功能增强。CRELD1过表达下调Aggrecan表达水平。CRELD1基因P286A突变下调Aggrecan表达水平,上调Tenascin-C表达水平,与AVSD发病有密切关系。