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硫酸鱼精蛋白是从各种鱼类精子中提纯的富含60%多精氨酸的强碱性蛋白,能够和负电性的肝素结合,作为肝素的拮抗剂,使肝素失去抗凝作用,通常用于体外搭桥和血液透析手术后中和肝素。目前鱼精蛋白是FDA和CFDA唯一批准拮抗肝素的药物。但鱼精蛋白在使用过程中有严重的不良反应,比如动脉低血压、肺动脉高压和过敏反应等。因此我们合成了鱼精蛋白模拟肽,其一是含有15个精氨酸残基的盐酸盐多肽(简称为R15),R15是一种强碱性多肽,理论分子量为2.362 kDa。药效学研究表明,鱼精蛋白模拟肽与鱼精蛋白具有相似拮抗肝素的能力,在临床使用剂量下无细胞毒性;半数致死量35.4 mg·kg-1,远低于临床使用剂量,安全范围大;较鱼精蛋白相比,免疫原性低。目前研究生物基质及溶液中鱼精蛋白模拟肽的方法还未开发,本论文旨在建立生物基质中R15的定量分析方法;对R15原料药及储备液的稳定性进行了初步考察;利用高效液相色谱法对R15的体外代谢稳定性、代谢相关酶及代谢产物鉴定进行深入的研究,阐明R15的代谢途径,为鱼精蛋白模拟肽的进一步化学修饰和筛选以及临床前药代动力学研究提供参考,降低新药开发的风险性。一、鱼精蛋白模拟肽原料药稳定性的初步研究目的:建立测定溶液中R15含量的高效液相色谱方法,并“参照化合药物(原料药和制剂)稳定性研究技术指导原则”,对R15的原料药及储备液进行稳定性考察。方法:建立高效液相色谱法,并对方法的准确度、精密度和重复性进行了考察;应用于R15储备液及原料药的稳定性。R15储备液在4℃放置15天,与当天样品进行比较,考察其储备液的稳定性;影响因素试验包括高温试验、高湿试验和强光照射,选择20℃±5℃为高温条件,高湿条件为92.5%RH,强光照射照度选择4500 Lx±500 Lx,研究R15的性状、澄清度、吸湿增重及其含量的变化。结果:UPLC方法能准确测定R15的含量,其浓度与UPLC响应值在20500μg·mL-1范围内呈现良好的线性关系,此方法的加样回收率为100.9%,精密度RSD为0.6%,重复性RSD为0.2%;鱼精蛋白模拟肽R15的储备液在4℃放置15天是稳定的;R15原料药在20℃±5℃、92.5%RH和4500 Lx±500 Lx条件下稳定。结论:建立了测定溶液中R15含量的UPLC方法;R15原料药的稳定性较好,为本多肽的成药性提供了依据,同时为原料药在储存和运输过程中提供参考条件;R15储备液放置4℃在15天内稳定,为鱼精蛋白模拟肽后续研究提供稳定性基础。二、大鼠全血中测定鱼精蛋白模拟肽UPLC分析方法的建立和验证目的:建立一种专一、准确、可靠的UPLC分析方法,测定大鼠全血中鱼精蛋白模拟肽R15的浓度,并且进行了完整的方法学验证,为鱼精蛋白模拟肽进一步研究提供必要的技术条件。方法:采用高效液相色谱,考察了洗脱梯度、流动相和沉淀剂等条件,确定色谱条件,经Thermo BioBasic-18色谱柱(300?,2.1 mm*100 mm,5μm)分离,柱温为55℃,以水(含0.05%三氟乙酸)-乙腈(含0.05%三氟乙酸)为流动相,流速为1mL·min-1,进样体积10μL,检测波长210 nm,异丙醇-甲醇-水(2:2:1)为洗针溶液。用外标法,全血样品的沉淀剂选择10%三氟乙酸-乙腈-水;并验证方法的选择性、标准曲线、准确度、精密度、样品稳定性和提取回收率。结果:R15浓度与其响应值在251000μg·mL-1范围内线性良好,定量下限为25μg·mL-1,R15的批内、批间RSD分别为1.8%5.2%和3.3%12.4%,RE%为3.4%7.0%,R15的提取回收率为99.4%100.4%;R15未处理全血样品在冰浴条件下(0℃)10 min内是稳定的,处理后的全血样品在4℃放置24 h和进样仓放置48 h的稳定性良好。结论:该方法专属性强、准确、可靠,方法学验证符合生物分析方法指导原则的要求,可应用于测定分析大鼠全血中鱼精蛋白模拟肽的浓度,为鱼精蛋白模拟肽的代谢稳定性和代谢相关的肽酶提供技术条件。三、鱼精蛋白模拟肽体外代谢稳定性研究和代谢产物的鉴定目的:比较R15在不同组织包括Wistar大鼠、比格犬和人的全血、大鼠肝脏匀浆、肾脏匀浆中的代谢稳定性,并鉴定大鼠全血中的代谢产物,得出R15在不同种属的全血和大鼠肝肾匀浆代谢的消除半衰期,并进行不同种属消除速率的比较。方法:采用底物消除法,将R15与不同的生物基质在37℃水浴条件下孵育;分析R2R15精氨酸肽段出峰时间,初步判断R15在大鼠全血中的代谢产物;使用UPLC方法定量分析R15的浓度及代谢产物的鉴定。结果:鱼精蛋白模拟肽R15在大鼠全血、肝匀浆和肾匀浆中均有代谢,半衰期分别为15.6 min、27.4 min和9.1 min,在肾脏中消除最快;在比格犬和人全血中的半衰期分别为11.9 min和21.0 min。鱼精蛋白模拟肽在大鼠全血中发现三个代谢产物M1、M2和M3,通过UPLC分析R2R15精氨酸肽段,得知M1、M2、M3可能分别为R14、R13、R12。结论:在大鼠全血、肾匀浆、肝匀浆中鱼精蛋白模拟肽均有代谢,在肾脏中消除最快,得出R15C主要通过肾脏代谢;在不同种属全血的降解速率为比格犬>大鼠>人;大鼠全血的三个代谢产物可能分别为R14、R13、R12。四、鱼精蛋白模拟肽代谢酶表型的研究目的:研究参与R15代谢相关的肽酶,得出参与R15在大鼠全血、肝脏匀浆和肾脏匀浆代谢的蛋白水解酶类型。方法:采用底物消除法,选择适当的蛋白水解酶浓度,将其与R15进行体外孵育;使用UPLC方法定量分析R15,判断抑制R15的蛋白水解酶类型。结果:鱼精蛋白模拟肽在大鼠全血中EDTA抑制剂组抑制率为92.7%,并且抑制了代谢产物R14、R13、R12的生成,抑肽素(Pepstatin)和苯甲脒(Benzamidine HCl)抑制组抑制率分别为41.3%和33.0%,并且均抑制了代谢产物R12的生成;丝氨酸抑制剂(AEBSF)、亮肽素(Leupeptin)、胰蛋白酶抑制剂(Trypsin)等抑制剂组抑制率较低,推测其可能参与R15的代谢;抑肽酶(Aprotinin)、糜蛋白抑素(Chymostatin)和膦酰二肽(Phosphoramidon)与对照组无统计学差异,对R15无代谢作用。在大鼠肝匀浆、肾匀浆中EDTA抑制剂组抑制率分别为90.2%,81.3%,在肝匀浆中N-乙基马来酰亚胺(N-Ethylmaleimide,NEM)和塞奥芬(DL-thiorphan)抑制组抑制率分别为86.5%和41.2%。结论:通过不同生物基质中各种蛋白水解酶对R15代谢的影响,得出结论,金属羧肽酶是R15的主要代谢酶,其次是半胱氨酸肽酶,另外,丝氨酸肽酶也对R15有一定的代谢。推测R15的代谢途径是通过羧肽酶从多肽C末端开始断裂,水解成精氨酸片段。在蛋白水解酶筛选过程中,丝氨酸肽酶抑制了代谢产物R12的生成。