第一部分大鼠小肠移植慢性排斥反应模型的建立及病理学比较目的采用F344→Lewis大鼠组合初步建立大鼠小肠移植慢性排斥反应模型,观测小肠组织慢性排斥病理表现。方法利用显微外科技术构建异系异位和异系原位大鼠小肠移植模型,术后0-14天给予皮下注射环孢素。术后90天进行移植物活检,常规病理学检测。乳果糖／甘露醇比值、D-木糖吸收实验检测移植肠功能。结果(1)异位和原位小肠移植大鼠均能长期存活,大部分超过90天。(2)异位小肠移植在术后90天出现典型的慢性排斥反应的病理学特征,包括粘膜结构改变、间质纤维化、白细胞浸润和动脉内膜增殖。(3)术后90天的原位移植小肠组织学形态相对正常。原位小肠移植大鼠在术后150天左右具有慢性排斥的病理组织学特征,但病变程度轻于术后90天的异位移植小肠。(4)大部分原位小肠移植大鼠在术后150天出现持续的体重下降,且不能被环孢素逆转。当体重下降超过30%时,乳果糖／甘露醇比值和D-木糖吸收实验结果证实移植肠功能下降。结论(1)异位小肠移植在术后90天出现典型的慢性排斥反应的病理学改变,而原位小肠移植在该时间点无慢性排斥反应改变。(2)原位小肠移植于术后150天左右出现慢性排斥改变,以持续性体重下降为临床表现,并伴随肠道吸收功能以及屏障功能的下降。(3)F344→Lewis异位小肠移植手术操作相对简单,经练习后手术成功率可达85%以上。(4)由于异位小肠移植可以出现典型的慢性排斥反应的组织病理学特征,故后继实验采用F344→Lewis异位小肠移植模型,并根据组织病理学检查结果确定术后90天为观察终点。第二部分大鼠异位小肠移植慢性排斥反应的研究目的建立大鼠异位小肠移植模型并研究相关慢性排斥反应机理。方法利用显微外科技术构建同系和异系大鼠小肠移植模型,分为3组：同系移植组、异系移植组、异系治疗组(给予环孢素)。分别在术后7天、14天、30天、60天、90天进行移植物活检,常规病理学检测,建立小肠移植排斥反应组织学评分标准。应用Real time-PCR技术检测移植物内TGFβ1、PDGF、PDGF-C mRNA转录水平,采用免疫组织化学方法检测CD68、TGFβ1、PDGF-C表达情况。结果(1)异系对照组全部大鼠均在术后15天内死亡。(2)异系治疗组自术后14天开始炎细胞浸润程度病理评分显著高于同期同系对照组,术后30天粘膜结构变化以及纤维化程度病理评分显著高于同期对照组,术后60天动脉内膜增殖开始有显著差异(3)CD68检测提示在慢性排斥反应全程CD68的表达持续升高,术后60天达最高水平。(4)异系治疗组的TGF-β1及PDGF-C mRNA转录水平和蛋白表达水平在第60天较同期的同系移植组显著升高,免疫组化可见TGF-β1在间质高表达,PDGF-C主要由组织细胞高表达于胞浆及胞膜。结论(1)术后第60天环孢素组的单核巨噬细胞浸润严重,同时伴TGFβ1、PDGF-C的高表达。(2)异系治疗组术后60天即可出现慢性排斥反应表现,并同时伴有CD68、TGFβ1、PDGF-C分子的显著高表达,提示CD68、TGFβ1、PDGF-C对于判定慢性排斥反应具有指导意义。第三部分大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定目的建立稳定的大鼠间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定方法,为进一步开展研究MSCs对小肠移植慢性排斥反应的影响提供细胞来源。方法选用1月龄清洁级Lewis大鼠,处死消毒后取其长骨,用PBS缓冲液冲洗骨髓腔,收集冲洗液,采用密度梯度离心法分离获取细胞,培养后取贴壁细胞进行传代培养。取第3代生长状态良好的细胞,0.25%胰蛋白酶-EDTA消化制成细胞悬液计数并记录生长曲线。取第3、4、5代生长状态良好细胞,以流式细胞术鉴定细胞表型。取第3代MSCs定向诱导分化成骨细胞,采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色进行成骨细胞鉴定。CFSE标记第3代MSCs并观察标记效率。结果(1)体外培养的原代MSCs72小时可见贴壁细胞,3周左右可达到90%的融合,2代后即可得到较为纯化的MSC成纤维样细胞。(2)流式细胞仪检测第3代MSCs表面标记物CD29、CD90的阳性率可达96%以上,CD34、CD45的阳性率低于3%。(3)碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果证实成骨细胞诱导成功。(4)用CFSE进行细胞标记后,荧光显微镜下见几乎所有MSCs均已被标记绿色荧光,流式细胞仪检测结果显示标记比例达100%,提示CFSE标记效率高。结论(1)MSCs是一类增殖能力旺盛,具有多向分化潜能的干细胞。(2)密度梯度离心联合贴壁培养法是一种简便易行的培养MSCs方法,操作简单,成功率高,可以作为培养大鼠骨髓MSCs的常规方法。(3)CFSE标记可作为标记MSCs的一种有效手段。第四部分大鼠骨髓间充质干细胞体外免疫抑制功能的实验研究目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在混合淋巴细胞培养反应中对同种异体脾细胞免疫应答反应的影响,并初步探讨其作用机制。方法建立MSCs和同种异体脾细胞共培养体系,反应体系总量300ul,以刀豆蛋白A为刺激因素,CFSE标记部分反应细胞。共分4组：①脾细胞,②脾细胞+conA,③脾细胞+MSCs,④脾细胞+MSCs+conA,每组6复孔,每孔脾细胞数5×105个,MSCs为105个,ConA终浓度为10ug/ml。混合培养72小时后,于倒置荧光显微镜下观察细胞增殖情况,流式细胞仪分析荧光强度以及CD4、CD8比例。结果MSCs和脾细胞共培养组未见明显的增殖子峰,其中CD4、CD8阳性细胞表达明显下降,而CD4/CD8比值无明显变化。结论骨髓MSCs体外能够抑制刀豆蛋白A引起的淋巴细胞增殖反应,对CD4 T细胞、CD8 T细胞均有抑制作用。第五部分受体源骨髓间充质干细胞对大鼠异位小肠移植慢性排斥反应的影响目的研究静脉输注受体骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠异位小肠移植慢性排斥反应的影响及其机制。方法利用显微外科技术构建异系小肠移植模型16只,随机分为2组：对照组和MSCs输注组。小肠移植后24小时,确定手术成功后,MSCs组自阴茎背静脉输注骨髓间充质干细胞107个(溶液为2ml生理盐水),对照组给予同体积的生理盐水,术后0-14天两组均给予环孢素处理。观察两组移植大鼠术后生存状态,于术后第60天全部剖杀获取移植小肠。常规病理学检测,进行慢性排斥反应病理评分。应用Realtime-PCR技术检测移植物内TGFβ1、PDGF-C mRNA转录水平,采用免疫组织化学方法检测CD68、PDGF-C表达情况。另外再建立两只大鼠异位小肠移植模型,给予环孢素处理,术后24小时给予阴茎背静脉输注标记了荧光CFSE的骨髓MSCs,术后7天剖杀获取移植小肠以及自体其他组织器官备冰冻切片检查以观察MSCs在受体内的定位。结果(1)输注的骨髓MSCs可特异的定向迁移至移植小肠。(2)术后60天MSCs组小肠标本的粘膜结构、炎细胞浸润、纤维化程度和动脉内膜增殖程度的评分与环孢素组均有统计学差异。(3)术后60天MSCs组小肠标本表达CD68、TGFβ1、PDGF-C分子水平均低于环孢素组。结论MSCs在一定程度上能移抑制慢性排斥的进程,其作用机制可能是MSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用,减少了巨噬细胞浸润以及TGFβ1、PDGF-C分子的表达。