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目的:本研究将分别利用APPswe/PS1d E9(APP/PS1)和APPswe/PS1M146V/tau P301L(3xTg-AD)转基因小鼠模型,应用Western-blotting,免疫组织化学和透射电镜的实验手段,观察AD模型小鼠小脑内突触相关蛋白表达以及超微结构的改变,探讨AD小脑突触功能变化的可能机制,为进一步揭示小脑在AD发生中的作用提供新的理论依据。方法:选用9月龄,雄性APP/PS1双转基因小鼠、3xTg-AD基因小鼠与对照野生型C57BL/6J小鼠(wild type,WT)。将其分为野生型组(WT)、双转基因组(APP/PS1)、三转基因组(3xTg-AD)。实验动物由中国医学科学院医学实验动物研究所基因工程平台和The Jackson Laboratory公司提供。饲养环境自然昼夜节律光照,自由摄食进水,通风良好。随机将每组小鼠分成三个小组,分别进行免疫组化、Western-blotting、透射电镜实验。(1)免疫组化实验:小鼠心脏灌注,固定后取脑组织,冷冻于-80℃,随后切片进行免疫组织化学实验。脑片厚度为30μm,驴血清进行封闭,一抗4℃过夜,二抗孵育,显色,透明,封片,每步间均用PBS进行漂洗3次,每次5 min,显微镜下观察比较各组小鼠小脑皮质内Aβ斑块(6E10)、突触素(Synaptophysin)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和其高亲和力受体(Tyrosine kinase B,Trk B)的表达。(2)Western-blotting实验:提取小鼠小脑组织蛋白,制备凝胶,蛋白加样后,80V电压电泳。之后转膜,BSA封闭,一抗4℃过夜,二抗孵育,最后显影曝光,用曝光仪分析电泳目的条带(Synaptophysin、BDNF、Trk-B和β-actin)的表达变化。(3)透射电镜实验:经心脏灌注、固定后取出小脑,将小脑皮质切成1mm×1mm×1mm的组织块,4%多聚甲醛固定后,用p H7.2磷酸缓冲液冲洗,置于锇酸中后固定,双蒸水冲洗。脱水,丙酮与包埋剂混合,室温浸透,环氧树脂包埋,浸透、聚合。用超薄切片机切片,醋酸铀-柠檬酸铅双染,透射电镜下观察并拍照[1],并对突触相关指标进行定量分析。结果:(1)APP/PS1组和3xTg-AD组转基因小鼠小脑皮质内均有少量Aβ斑块的沉积。(2)Western-blotting实验结果显示,与WT组相比,APP/PS1组和3xTg-AD组转基因小鼠小脑内突触素(Synaptophysin)含量明显减少(APP/PS1:P<0.01,3xTg-AD:P<0.01)。免疫组化实验结果显示,APP/PS1组小鼠小脑分子层(P<0.01)、浦肯野细胞层(P<0.01)和颗粒细胞层(P<0.01)中突触素阳性表达均明显减少;3xTg-AD组分子层(P<0.01)、浦肯野细胞层(P<0.01)和颗粒细胞层(P<0.01)中的光密度值亦明显减少,但与APP/PS1组相比,没有统计学差异(P>0.05)。两组小鼠小脑内浦肯野细胞形态均无明显改变。(3)Western-blotting实验结果显示,与WT组相比,APP/PS1组和3xTg-AD组转基因小鼠小脑内,BDNF的含量均明显减少(APP/PS1:P<0.01,3xTg-AD:P<0.01),Trk-B含量也明显减少(APP/PS1:P<0.01,3xTg-AD:P<0.01)。免疫组化实验结果显示,APP/PS1组和3xTg-AD组分子层浦肯野细胞层(APP/PS1:P<0.01,3xTg-AD:P<0.01)和颗粒细胞层内(APP/PS1:P<0.01,3xTg-AD:P<0.01)阳性颗粒均明显减少,但分子层内BDNF阳性表达均无显著改变(APP/PS1:P>0.05,3xTg-AD:P>0.05)。APP/PS1组和3xTg-AD组小脑皮质各层内Trk-B阳性颗粒明显减少,相对光密度值在分子层(APP/PS1:P<0.001,3xTg-AD:P<0.001)、浦肯野细胞层(APP/PS1:P<0.001,3xTg-AD:P<0.001)以及颗粒细胞层(APP/PS1:P<0.001,3xTg-AD:P<0.001)内均明显降低。但APP/PS1组和3xTg-AD组之间没有统计学差异(APP/PS1:P>0.05,3xTg-AD:P>0.05)。此外,在光镜下AD小鼠浦肯野细胞有树突变短,分枝减少等形态学变化。(4)电镜观察结果:APP/PS1组和3xTg-AD组转基因小鼠均有细胞核凋亡现象,如电子密度增高,核固缩及异染色体边集。两种转基因小鼠小脑皮质内均发现有线粒体肿胀及空泡化,甚至线粒体嵴断裂和结构不完整等现象。同时还伴有细胞骨架破坏,双螺旋细丝样(PHFs)等结构变化。3xTg-AD组甚至还出现微管断裂的现象。此外,APP/PS1组和3xTg-AD组转基因小鼠小脑皮质内平行纤维-浦肯野细胞间突触(PF-PC)的形态学参数也发生明显变化:突触间隙变宽(APP/PS1:P<0.001,3xTg-AD:P<0.001),突触后致密区(PSD)变薄(APP/PS1:P<0.001,3xTg-AD:P<0.001),PSD弧度变短(P<0.05)及突触曲率变小(P<0.001)。结论:(1)AD转基因小鼠小脑内出现AD特异性病理改变。(2)AD小鼠小脑内突触超微结构及相关蛋白发生明显变化,可能与BDNF合成减少有关。(3)APP/PS1组和3xTg-AD组转基因小鼠间,小脑突触超微结构及相关蛋白无显著性差异。