结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,在欧美发达国家,其发病率、死亡率数十年来并没随着医疗技术及癌症研究的发展而明显改善。2007年,美国结直肠癌的发病率和死亡率在男、女性中仍居恶性肿瘤的第三位。在我国,结直肠癌发病率总体呈上升趋势并已位居恶性肿瘤的第三位。随着人们膳食结构和生活方式的西方化,近二十年我国也将进入结直肠癌发病的高峰期。结直肠癌的发生发展是个多步骤多阶段、多基因参与的过程,其中正常黏膜-腺瘤-腺癌途径是最重要的发生模式。结直肠腺瘤,作为结直肠癌的癌前病变,对于它的研究,将有助于了解结直肠癌发生的早期分子事件,对结直肠癌早期诊断和治疗意义重大。要揭示结直肠腺瘤发生演进的机制,首先就应了解正常肠黏膜和腺瘤之间复杂的分子差异。我们实验室于1999年应用抑制性差减杂交法(suppressivesubtraction hybridization,SSH)利用一个同时患有结直肠腺瘤和腺癌的病例构建了三个cDNA差减文库,即腺瘤相对于正常黏膜的差异片段文库(A-N),腺癌相对于正常黏膜的差异片段文库(T-N)和腺癌相对于腺瘤的差异片段文库(T-A)。前期的Northern blot和反向Northern验证,已帮助我们发现了一些有意义的基因。因此,我们对A-N文库全部109个差异表达的cDNA克隆进行了测序,利用自行搭建的核酸序列分析平台及在线Webgestalt分析工具对这些差异表达候选基因进行了总体分析。随后对一些感兴趣的基因进行了验证,并对2个基因进行了深入细致的研究。借此,以揭示结直肠腺瘤的整体分子特征,寻找用于早期诊断、治疗及预后的分子标志物。首先,为了能高效准确自动化地获得这109个差异表达cDNA克隆所代表的基因,我们建立了从EST测序峰图文件到候选基因的核酸序列自动化分析平台。该平台由自行整合的核酸序列分析程序包(软件登记号:2005RS01351)和自行编写的GetUni软件包(软件登记号:2005SR10081)两个能独立执行功能的软件组成。利用该分析平台,及下载到本地计算机的核酸非冗余数据库和人类UniGene数据库,我们最终获得62个差异表达候选基因。这62个基因的基本信息(如基因序列号,基因名称、基因代码、染色体定位等)及出现次数被自动以Excel格式输出并保存于本地计算机。随后,为从整体上分析这些基因的分布特征,获得基因的分子功能,涉及的信号通路等信息,我们利用Gene Ontology网站进行了WebGestalt分析(WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit,http://bioinfo.vailderbilt.edu/gotm/)。在线分析显示,按照生物学过程分类(Level 4),62个候选基因在细胞代谢(cellularmetabolism)、大分子代谢(macromollieulr metabolism)、初级代谢(primary metabolism)等3个层面的分布最为集中,其中包括6个核糖体蛋白基因家族成员。分子功能分类(Level 4)则以嘌呤核苷酸结合(purine nucleotide binding)相关基因居多。KEGG信号通路分析,发现候选基因中共有50个基因参与38条信号通路,其中有6个基因与核糖体通路相关,2个基因参与MAPK通路。Biocarta信号通路分析,共有29个基因参与25条信号通路,各有2个基因参与IL5信号通路(IL5 Signaling Pathway)、抗原处理和提呈(Antigen Processing and Presentation)和过敏反应中化学因子网络中嗜酸性粒细胞作用(The Role of Eosinophils in the Chemokine Network of Allergy)等3条免疫相关信号传导通路。为了验证A-N文库筛选的结果,我们对文库中代表性基因的mRNA表达水平进行了检测。我们选择了文库中出现次数相对较多的REG4、PERP、YWHAZ及KLF4基因,采用SYBR Green荧光定量PCR方法在8例结直肠正常黏膜-腺瘤-腺癌(N-A-T)配对组织,49例结直肠正常黏膜-腺癌(N-T)配对组织中检测其mRNA的表达水平。结果显示在受检的8例N-A-T配对、49例N-T配对样本中,REG4在7例腺瘤,23例腺癌中的表达高于配对正常黏膜(中位表达倍数分别为2.263、0.982),并在6例N-A-T配对组织腺瘤中的表达高于正常黏膜及腺癌。其在腺瘤中的表达显著高于配对正常黏膜(p=0.036)。PERP在6例腺瘤,39例腺癌中的表达高于正常黏膜(中位表达倍数分别为2.146、1.941),并在5例N-A-T配对组织的腺瘤中的表达高于正常黏膜及腺癌。PERP在腺瘤及腺癌中的表达均显著高于配对正常黏膜(p=0.036,p=0.000)。YWHAz在5例腺瘤,31例腺癌中的表达高于正常黏膜(中位表达倍数分别为1.339、1.200),其在4例N-A-T配对组织的腺瘤中的表达高于正常黏膜及腺癌,其在腺癌中的表达显著高于配对正常黏膜(p=0.03)。KLF4仅在2例腺瘤,4例腺癌中高表达(中位表达倍数分别为0.521、0.230),而其在腺癌中表达显著低于配对正常黏膜(p=0.000)。至此,A-N文库筛选出的在结直肠腺瘤中高表达的基因得到了较好的验证。加上前期已验证的6个核糖体蛋白基因及C60rf37基因,体现了SSH方法的可靠性。鉴于PERP是新近发现在肿瘤转移细胞系中低表达的新基因,可能是p53下游的效应分子。因此,我们对在结直肠腺瘤及腺癌中均显著高表达的PERP基因进行了表达及功能的深入研究。首先,利用组织芯片(TMA)结合RNA原位杂交(ISH)和免疫组化(IHC)技术,分别从mRNA及蛋白水平检测了PERP在结直肠组织中的表达情况。结果显示,PERP mRNA在结直肠正常黏膜的隐窝下部表达较上部高,其在结直肠正常粘膜、腺瘤及腺癌组织中表达率分别为62.5%,97.6%,88.9%。PERP在结直肠腺瘤、腺癌组的表达显著高于正常粘膜组(p=0.000,p=0.000),腺瘤与腺癌组无显著差异(p=0.249),其在腺瘤及腺癌中的表达显著高于配对正常黏膜(p=0.046,p=0.000)。PERP蛋白在正常结直肠黏膜、腺瘤及腺癌组织中表达率分别为67.7%,84.2%,81.5%。腺瘤与腺癌组的表达显著高于正常黏膜组(p=0.001,p=0.001),腺瘤组与腺癌组间无显著差异(p=0.564)。PERP蛋白在腺癌中的表达显著高于其配对正常黏膜(p=0.000)。为了探究PERP表达与p53蛋白表达的关系,我们对同批组织芯片进行了p53蛋白的检测。统计结果显示,p53蛋白在正常结直肠黏膜、腺瘤及腺癌组织中表达率分别为3.17%,78.10%,71.90%。腺瘤组及腺癌组中的表达显著高于正常黏膜组(p=0.000,p=0.000),腺瘤与腺癌组间差异不显著(p=0.170)。其在腺癌中的表达显著高于配对正常黏膜(p=0.000)。随后,我们进行的相关性分析发现,PERP mRNA及蛋白水平与p53蛋白水平均成正相关,相关系数分别为r=0.452(p=0.000);r=0.341(p=0.000)。为探讨PERP在结直肠肿瘤中的可能作用,我们构建含有PERP全长编码区的真核表达型质粒PcDNA3.1-PERP CDs,对不表达或低表达内源性PERP基因的结直肠癌LoVo和RKO细胞株进行了基因转染,并检测了转染PERP后的生物学效应。通过G418药物筛选,我们得到稳定表达外源性PERP的LoVo-CDs和RKO-CDs细胞株。MTT细胞增殖能力检测结果显示:转染PERP能促进LoVo和RKO细胞株的生长(p=0.000,p=0.058)。PI单染,PI/Annexin V双染的流式细胞术检测发现:转染PERP对LoVo和RKO细胞株的凋亡和周期无明显影响。检测细胞迁移能力的划痕实验显示转染PERP基因,增强了LoVo细胞株的迁移能力。但是,由于构建A-N文库时使用的是来源于一个病例的样本,造成了筛选结果的偏倚。如我们发现KLF4基因Q-PCR的验证结果与文库筛选结果相反。但是,新近不少研究发现KLF基因家族与细胞的分化成熟有关,已成为癌症研究中的热点。肠道由于其黏膜隐窝的增殖-分化动力学,成为研究细胞分化成熟的良好模型。我们Q-PCR的结果显示KLF4在正常黏膜-腺瘤-腺癌中的表达依次降低,该现象不仅提示了KLF4基因的表达与细胞分化成熟相关,更支持了长期存在的“肿瘤是细胞分化紊乱或逆向分化”的理论,引起我们极大兴趣。因此,我们对KLF4在结直肠中的表达情况进行了比较全面的临床病理研究。首先,我们利用免疫组织化学方法检测了KLF4蛋白在结直肠组织中的表达及分布情况。由于KLF4可能与细胞分化成熟相关,在分析免疫组化结果时,我们将结直肠黏膜隐窝分成上1/2和下1/2进行精细定量分析。我们发现,所有的(73/73)的结直肠正常黏膜均表达KLF4,KLF4+细胞主要位于隐窝上部。隐窝上1/2阳性细胞数(35.7%±19.0%)显著高于隐窝下1/2(11.4%±9.8%)(p＜0.01)。在结直肠腺瘤,虽然KLF4+细胞数显著低于正常黏膜,但其分布模式与正常黏膜相似,异形增生的隐窝上1/2阳性细胞数(19.7%±20.5%)显著高于下1/2(9.0%±13.4%)(p＜0.01)。腺瘤KLF4+细胞(15.0%±16.3%)显著低于瘤旁残留黏膜(30.6%±13.5%)。而腺癌中,KLF4弥散表达,总体阳性率仅3.0%±6.72%,显著低于配对癌旁残留黏膜(2.0%±4.6%vs23.4%±11.5%)(p＜0.01)。从整体来看,KLF4蛋白在正常黏膜(23.5%±13.0%)、腺瘤(15.0%±16.3%)、腺癌(3.0%±6.72%)中的表达依次降低,且差异均显著(p＜0.01)。结直肠正常黏膜、腺瘤、腺癌KLF4阳性率分别为100%(73/73),58.3%(28/48)、38/129(29.5%)。腺瘤与腺癌的阳性率显著低于正常黏膜(p＜0.001)。低级别腺瘤中KLF4阳性率(26/39)显著高于高级别腺瘤(2/9)(p＜0.01)。在大于60岁或肿瘤芽较多(≥15)的结直肠癌病例中表达显著下降(p＜0.01,p＜0.01)。KLF4表达阳性病例总体生存率(76.3%,29/38)高于KLF4阴性病例(68.1%,62/91),阳性病例5年生存率(67.9%,19/28)高于阴性病例(51.7%,30/58)(p=0.172),阳性病例的5年累积生存率高于阴性病例(74%vs 63%,p=0.379)。在发生淋巴结转移的病例中,KLF4表达阳性的预后相对阴性的病例较好(p=0.252)。为了探讨KLF4在结直肠肿瘤中低表达的原因及其与细胞分化之间的关系,我们利用去甲基化药物5-aza-dC和促分化药物丁酸钠处理结直肠癌细胞株SW480、SW620和RKO。Q-PCR检测处理前后KLF4 mRNA的表达变化。结果显示:5-aza-dC处理SW480、SW620及RKO后,KLF4的表达分别升高1.14、5.49及2.10倍。丁酸钠处理后,KLF4在SW480、SW620及RKO细胞系中的表达分别升高1.39、1.57及1.47倍。其中5-aza-dC处理显著上调了SW620细胞株KLF4基因的表达(p＜0.01)。通过上述研究,我们得出以下结论:(1)我们成功建立了从EST测序峰图到候选基因的核酸序列自动化分析平台。利用该平台结合在线WebGestalt分析,有助于从整体水平揭示结直肠腺瘤的分子特征,发现结直肠肿瘤发生发展的早期分子事件,寻找用于早期诊断、治疗及预后的分子标志物。(2)PERP基因在结直肠肿瘤中高表达,其在结直肠癌中的高表达可能与p53基因的突变有关。PERP能促进结直肠癌LoVo,RKO细胞株的增殖和迁移能力。(3)KLF4基因与结直肠黏膜终末分化相关。其在结直肠肿瘤中的低表达可能与其基因高甲基化状态有关。KLF4低表达是结直肠癌淋巴结转移病人预后不良的潜在指标。(4)抑制性差减杂交(SSH)仍不失为一种寻找差异表达基因的方法,但是进行数据分析时要谨慎。利用SSH构建差异表达基因文库有助于我们阐述疾病发生的分子机制,寻找用于早期诊断、治疗及预后的分子标志物。