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目的:由于人们饮食结构和生活方式的改变,全世界范围内肥胖的发生率呈现逐年上升趋势。肥胖是一种脂质代谢紊乱状态,会导致机体中游离脂肪酸水平的升高,而游离脂肪酸水平的升高被认为是导致心力衰竭的重要危险因素。此外,我们在前期体内/体外的实验研究中也证实,棕榈酸(palmitic acid,PA)——一种饱和脂肪酸能够减少心肌细胞活性,诱导心肌的脂毒性损伤的发生。因此PA-诱导的心肌脂毒性损伤被认为是肥胖导致心肌损伤的一个重要因素之一,但目前机制尚不清楚。依此,深入探索饱和脂肪酸诱导心肌脂毒性的发生机制,挖掘出新的治疗靶点,对于预防和治疗肥胖诱发的心肌损害具有重要的意义。长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)是通常指转录本长度大于200个核苷酸,不具备蛋白质编码能力的一类RNA分子,其属于非编码RNA家族的重要成员之一,也是目前生命科学研究领域中的热点。尽管LncRNA通常不直接参与编码蛋白质,但它却可以在转录水平、转录后水平以及表观遗传学等多个不同层次来对基因的表达进行调控。近来研究发现,多个LncRNA被证实参与调控PA诱导的肝细胞、卵巢细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等的脂毒性损伤。然而,LncRNA在心肌脂毒性损伤的研究目前尚未见文献报道。生长停滞特异性转录本5(growth arrest-specific transcript 5,GAS5)是一种LncRNA,最早在生长停滞的小鼠NIH 3T3细胞中表达升高而被鉴定出来。GAS5参与了肿瘤发生和转移、缺血卒中、肝和心肌纤维化、以及骨关节等疾病发生的病理生理过程。GAS5主要在细胞浆中表达,其可在转录后水平通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)机制调控miRNA及其靶基因的表达。我们通过生物信息学软件预测到GAS5与miR-26a存在特异性结合位点,而miR-26a可以抑制靶基因高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)表达,进而抑制TLR4/NF-κB信号通路,减少炎症因子的释放。因此,我们推测GAS5、miR-26a和HMGB1三者构成ceRNA网络参与调控心肌脂毒性损伤。本研究以H9c2大鼠心肌细胞为研究对象,通过PA诱导心肌脂毒性损伤细胞模型,明确GAS5在心肌脂毒性损伤中发挥的作用,初步探讨GAS5参与调控心肌脂毒性损伤的可能机制。研究方法:1.使用400μM PA处理H9c2大鼠心肌细胞24h,通过油红O染色的方法评估细胞内脂质沉积情况,建立心肌细胞脂毒性损伤模型。2.通过RT-qPCR的方法检测PA处理后心肌细胞GAS5表达情况。3.将GAS5特异性干扰小RNA(si-GAS5)转染H9c2细胞,24h后通过RT-qPCR的方法检测心肌中GAS5表达下降的程度来验证si-GAS5沉默效率。进一步应用CCK-8法检测心肌细胞生存能力,比色法检测心肌细胞LDH释放量来评估心肌损伤程度,RT-qPCR和酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法检测TNF-ɑ和IL-1β的mRNA表达和活性。4.应用荧光素酶报告基因实验来确定GAS5与miR-26a是否存在特异性结合。将si-GAS5转染心肌细胞后,通过RT-qPCR检测miR-26a表达变化,反之,将miR-26a inhibitor转染心肌细胞后检测GAS5表达变化。进一步验证GAS5与miR-26a之间彼此之间是否存在交互抑制作用。5.将si-GAS5和miR-26a inhibitor共染心肌细胞后,RT-qPCR和Western blot检测HMGB1表达变化,Western blot和ELISA检测NF-κB表达和转录活性变化。6.统计方法:所有计量资料的实验数据均以均数±标准差(±s)的形式表示。两组之间的数据比较采用两独立样本T检验的方法,两组以上数据的比较先采用单因素方差分析的方法进行分析,如果组间差异显著,再进一步应用LSD检验的方法进行两两比较。所有统计分析采用软件SPSS 17.0版本,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1.与对照组(control)比较,H9c2心肌细胞经过400μM PA处理24h后,在心肌细胞的胞质中出现大量的脂质沉积,同时细胞生存力显著降低,LDH释放量、TNF-ɑ和IL-1β的mRNA表达和活性均出现显著的升高(P<0.05),这一结果说明400μM PA可以成功诱导H9c2心肌细胞脂毒性损伤模型。2.RT-qPCR的结果显示,经PA处理12和24h以后,心肌细胞中GAS5表达量分别显著提高了3.65和7.82倍。这一结果说明PA处理可以诱导H9c2心肌细胞GAS5表达。3.转染si-GAS5可以降低心肌细胞内源性GAS5表达,同时转染siGAS5可以缓解PA导致的细胞活性减低、LDH释放量增加、TNF-ɑ和IL-1β的mRNA表达和活性增加。这一结果说明下调GAS5表达可以减轻PA诱导的心肌细胞脂毒性损伤。4.荧光素酶报告基因检测结果显示,当野生型荧光素酶载体与miR-26a xmimic共转后荧光素酶的值下降约70%,而突变型荧光素酶载体与miR-26a mimic共转后荧光素酶的值无明显降低。该实验结果证实GAS5与miR-26a存在的特异性的结合。5.RT-qPCR的结果显示,转染si-GAS5组心肌细胞miR-26a表达出现显著升高(P<0.05)。相应的,转染miR-26a inhibitor组心肌细胞GAS5表达也出现显著升高(P<0.05)。这一结果说明GAS5与miR-26a之间存在交互抑制作用。6.当转染si-GAS5后,HMGB1的mRNA和蛋白表达出现显著的下降(P<0.05),而其下游的NF-κB核内的表达量和转录活性也相应的出现显著下降(P<0.05)。这说明GAS5对HMGB1/NF-κB信号轴存在正向的调控作用。而当同时共转si-GAS5和miR-26a inhibitor的时候,HMGB1的mRNA和蛋白表达及NF-κB核内的表达量和转录活性没有出现显著的降低,这进一步说明miR-26a参与介导GAS5对HMGB1/NF-κB信号轴的调控作用。结论:1.PA刺激可以诱导心肌细胞中GAS5表达,下调GAS5表达可以减轻PA诱导的心肌细胞脂毒性损伤。2.GAS5可以通过miR-26a-HMGB1-NF-κB信号轴参与调节PA诱导的心肌脂毒性损伤。