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蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)是一族结构相似的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，在细胞增殖、分化、凋亡、基因表达、膜转运和信号转导等过程中起着重要的调节作用。到目前为止，在哺乳动物中已发现了至少11个PKC家族成员，它们的基本结构相似，在不同的外界信号刺激下，不同细胞中的各种PKC家族成员在细胞凋亡诱导中发挥了不同的作用。早期认为，PKCα是具有抗凋亡作用的生存因子，它可以抑制HL-60细胞、唾液腺上皮细胞、32D骨髓母细胞、成胶质细胞瘤U87和A172等细胞的凋亡。然而，随着研究的深入，在其它一些细胞，如LNCaP和唾液腺泡细胞中，都发现PKCα扮演了完全相反的角色——诱导细胞凋亡。 本论文致力于研究胃癌细胞中PKC的转运和细胞凋亡诱导的关系。TPA诱导的胃癌细胞凋亡不是通过上调PKC α,PKCβI，PKCζ或PKCλ的蛋白表达水平实现的，因为TPA不影响BGC-823中PKC α,PKCβI，PKCζ和PKCλ的蛋白表达水平。用免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下观察发现，在对照组BGC-823细胞中，PKCβI和PKCλ定位在细胞核，PKCζ在胞浆中丰富表达，PKCα定位于胃癌细胞线粒体及其周围胞浆。TPA不能诱导PKCβI，PKCλ和PKCζ在细胞中转运。但能诱导PKCα由线粒体和胞浆逐渐向细胞核转运，TPA处理48h，PKCα完全进入细胞核。这一诱导过程和TPA诱导的胃癌细胞凋亡密切相关，因为当用PKC抑制剂wort。或P.I.P阻断PKCα在细胞中的转运时，TPA诱导细胞凋亡率分别降低至7.1％和6.4％，接近对照组水平。TPA诱导BGC—823细胞的Bcl-2和BCL-XL表达下调，Bax、Caspase3和Caspase9表达上调，更重要的是这些蛋白表达水 刘苏硕士论文 摘要02－06－22 在细胞中的转运。这些结果都表明，TPA诱导的Nur77 mRNA表达和转运受％C信 号途径调控，并且它可能在Nur77参与的细胞凋亡的调节中扮演了重要角色。 本论文的创新点： 1 我们不仅首次在胃癌细胞中观察到PKC a定位于线粒体中；并能在 TPAd诱导下向细胞核转运，并且揭示了 PKC a的转运和TPA诱导的细胞凋亡之 问的联系。这将为深入了解细胞凋亡的机制提供新的思路。 2，在本论文中，我们还研究了核孤生受体Nur77和1‘肚信号途径问的联 系，并成功地证实了VA诱导的Nur77 mRNA表达和转运受队C信号途径调控。 这一发现在世界上也尚属首次。 刘苏硕士论文 摘要02－06、22 平的变化与 PKC a转运有关，一旦 PKC a转运被抑制，TPA就不能诱导这些蛋白表 达水平。这些结果说明，PKC a脱离线粒体和胞浆进入细胞核对于细胞凋亡诱导 可能有着机制上的内在关联。 Nur77（也称m3）是一个由立早基因 NR4AI编码的核孤生受体。Nur7？既能 以单体形式结合到其DNA识别元件NBRE上，还可以自身形成同源二聚体或与其 他Nu r 7 7家族成员形成异源＝聚体而结合到其另一识别位点NurRE，Nur77还可 以与视黄酸互受体＊etinoid X receptor，RXR）形成异源＝聚体，并结合在视黄 酸结合兀件 RARE（retionic acid response element）上．而发挥转录活性。 Nu r 7 7 的转录活性受到自身转录表达和翻译后修饰的水平上多个层次的调节。 Nu r 7 7在细胞的生长、分化、细胞凋亡等众多生理过程都发挥了重要的调节作 用。它参与了肺癌细胞、B细胞、前列腺癌细胞、T细胞杂交瘤和T淋巴细胞等 许多细胞细胞凋亡的调节。长期以来，Nur77参与的对细胞凋亡的诱导都被认为 与其转录活性激活有关。 本论文证实，TPA诱导的胃癌细胞凋亡与的mRNA表达和l转运有关，而与其转 录活性的激活无关。在饥C－823细胞中，TPA能够上调Nur77mRNA的表达水平， 并诱导Nur刀蛋白由细胞核向线粒体转运，由此引发线粒体上细胞色素c的释 放。但 TPA不能激活 Nur77的转录活性，我们用 CAT ass。沙检测发现，当含有 Nu r 7 7结合位点的CAT报告基因瞬时转染BGC－823细胞后，再用TPA处理，Nur77 的转录活性不会发生改变。Nur？7 的mRNA表达对TPA的凋亡诱导是必须的，当 antisense Nur77表达载体转染到 BGC－823细胞后，Nur77表达被抑制，此时TPA 就不能诱导细胞凋亡。TPA诱导的胃癌细胞凋亡还和Nur7：’的转运密切相关。当 LMB抑制了Nur77的转运时，TPA诱导的细胞凋亡率降低至对照组水平。 而且，我们还证实TPA诱导的Nur？7mRNA表达和蛋白转运受到PKC信号途径 调控，PKC特异性抑制剂可以抑制 TPA诱导的 Nur77 mRNA表达和Nur刀蛋白转 运。首先，Wort和 P．I．P可以显著抑制 TPA上调 Nur77 mllNA表达水平。其次， 免疫荧光发和western blot的结果都显示 Wortmannin和 P．I．P可以阻断 Nur77