铂类耐药是卵巢癌治疗的一大难题,其发生机制及如何逆转耐药是多年来研究的热点。近年来人们发现一些与靶点作用无关,却与肿瘤耐药相关的影响因素,例如自噬、Nrf2分子等。但是,这些因素参与卵巢癌耐药的机制尚不明了。因此,深入研究相关机制为寻找潜在靶点具有重要的临床意义。自噬(autophagy)是一种不同于凋亡的程序性死亡。当缺氧或饥饿时,细胞可形成双层皱褶包裹受损的细胞器及大分子物质,利用自身溶酶体进行消化,维持能量代谢平衡。自噬功能的异常可导致疾病的发生,如衰老、神经退行性病变等。自噬与肿瘤的研究颇具争议,部分研究表明自噬可抑制肿瘤形成,而其他研究认为自噬可促进肿瘤生长。自噬与肿瘤耐药的研究有相似的现象,不同的是大部分研究表明自噬活性增高与肿瘤耐药相关,而小部分实验表明耐药可损伤自噬功能。但自噬与卵巢癌耐药关系如何,罕见报道。Nrf2-ARE信号通路(NF-E2-related factor 2-antioxidant response element)是存在细胞中抗氧化应激的信号通路。当细胞受到氧化应激时,Nrf2分子高表达从而引起下游抗氧化反应元件的活化,发挥保护细胞的功能。近年研究表明高表达的Nrf2分子与肿瘤耐药相关。我们课题组前期工作发现耐药的卵巢癌细胞高表达Nrf2,下调Nrf2水平可提高细胞对顺铂的敏感性。但是Nrf2-ARE信号通路参与卵巢癌铂类耐药的分子机制不十分清楚。综上,我们课题组假想自噬与Nrf2-ARE信号通路在卵巢癌耐药中可能存在某种调节。本课题主要研究自噬及Nrf2-ARE信号通路在卵巢癌铂类耐药中的作用及初步探讨二者之间可能存在的调节机制。第一部分 自噬在卵巢癌铂类耐药中的相关性研究目的：探讨自噬对卵巢癌细胞铂类敏感性的影响。方法：以卵巢癌敏感细胞A2780及耐药细胞A2780cp为主要研究对象,经或不经顺铂处理后,通过Western blot、免疫荧光及电镜比较两种细胞间的自噬水平。对自噬水平高的细胞,通过自噬药物抑制剂3-MA或重要自噬基因beclin 1 siRNA转染下调自噬水平,检测细胞对顺铂敏感性及凋亡水平的改变。结果：耐药细胞A2780cp对顺铂的24小时半数抑制浓度是敏感细胞A2780的6.5倍,为卵巢癌铂类耐药研究提供了理想的研究模型。A2780cp细胞中自噬蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、beclin1蛋白表达显著高于A2780细胞；A2780cp细胞中免疫荧光LC3表达高于A2780细胞；在相同处理条件下,A2780cp细胞中自噬小体的数量显著多于A2780细胞。经3-MA与顺铂联合处理,A2780cp细胞对顺铂的敏感性显著增加,但对顺铂引起的凋亡无明显改变；经beclin 1 siRNA转染下调自噬水平后,A2780cp细胞对顺铂的敏感性及凋亡均显著增加。结论：卵巢癌耐药细胞的自噬水平高于敏感细胞。下调自噬水平,可增加耐药细胞对顺铂的敏感性。第二部分Nrf2-ARE信号通路在卵巢癌铂类耐药的作用及对自噬潜在调控机制的初步探讨目的：探讨Nrf2-ARE信号通路对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响及与自噬可能的调控机制。方法：通过Real-time PCR及Western blot方法比较卵巢癌敏感细胞A2780及耐药细胞A2780cp中Nrf2-ARE信号通路中重要基因Nrf2、Keap1、NQ01及HO-1中的表达差异。对于Nrf2高表达的细胞,经Nrf2 siRNA转染后检测细胞存活率及凋亡水平的改变。同时检测Nrf2 siRNA转染后细胞自噬水平发生的变化。结果：在mRNA水平,耐药细胞A2780cp中Nrf2、Keap1、NQO1及HO-1表达水平均高于敏感细胞A2780(除NQO1外,其他P<0.05)、Western blot结果与mRNA相一致。经Nrf2 siRNA下调耐药细胞中Nrf2水平,NQO1、HO-1表达水平随之下调,A2780cp细胞对顺铂的敏感性增加,同时Tune1染色后凋亡小体形成数目显著增多,流式细胞仪检测的由顺铂诱导的凋亡水平明显增加。前已证实耐药细胞中自噬水平高于敏感细胞,通过Western blot检测自噬相关蛋白,耐药细胞A2780cp中Atg3、Atg5、Atgl2及p62的表达均高于A2780。在A2780cp细胞中,Nrf2 siRNA转染后,自噬基因Atg3、Atg5、Atg6、Atg12及p62在mRNA及蛋白水平均随之下降,同时Nrf2下调后细胞的自噬小体形成数目显著减少。结论：卵巢癌耐药细胞中Nrf2-ARE信号通路活性高于敏感细胞。下调Nrf2水平,可增加细胞对顺铂的敏感性及凋亡水平。同时,Nrf2-ARE信号通路可能通过激活自噬参与卵巢癌铂类耐药的产生。