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目的:利用细胞和分子生物学手段,在转录和信号通路水平上,研究Nrf1降低MCF-7细胞对顺铂的敏感性,抑制顺铂诱导细胞凋亡的机制。方法:1.利用慢病毒包装及转染技术,筛选出Nrf1过表达及Nrf1敲降的稳定细胞株MCF-7,用慢病毒载体p LV07作为空白对照;2.用抗癌药顺铂(浓度梯度)分别处理过表达Nrf1的MCF-7,敲降Nrf1的MCF-7以及对照组细胞,48h后MTT法观察每组细胞对顺铂的药物敏感度;3.用3μM的顺铂处理对照组MCF-7之后,Western blotting技术检测顺铂对内源性Nrf1蛋白水平的诱导作用;4.用3μM顺铂处理过表达Nrf1,敲降Nrf1的MCF-7以及对照组细胞,Tunel法检测各组细胞具体的凋亡情况;利用Real-time PCR和Western blotting技术对各组细胞分别检测抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Caspase-3的表达情况;5.构建野生型Bcl-2启动子质粒以及删除ARE序列的突变型Bcl-2启动子质粒,利用荧光素酶报告基因实验(Luciferase assay)检测Nrf1对Bcl-2启动子区域转录活性的作用。结果:1.Western blotting技术证明稳定细胞株的筛选成功。2.MTT结果显示当顺铂浓度在3μM的时候,正常空白组细胞基本达到半数致死,而过表达Nrf1组细胞依然有72%的存活率。但是此时敲降Nrf1组细胞的存活率只有21%,明显低于正常组细胞。3.Western blotting技术证明当抗癌药顺铂处理正常空白组细胞后,内源性Nrf1的表达量比未用顺铂处理组高。4.Tunel实验结果显示顺铂处理的正常组MCF-7细胞凋亡率为54.2%,过表达Nrf1组细胞药物处理之后细胞凋亡率只有28.1%,而敲降Nrf1组细胞药物药物处理之后细胞凋亡率上升到了83%。5.Real-time PCR和western blotting实验结果显示当Nrf1过表达时,Bcl-2的m RNA水平和蛋白水均上调,而Caspase-3的m RNA水平和蛋白水平下调。但是Nrf1敲降细胞组,Bcl-2和Caspase-3的表达情况与Nrf1过表达组相反。6.荧光素酶报告基因实验结果显示Nrf1过表达组Bcl-2启动子的转录活性明显高于对照组,当ARE序列部分去除之后,Nrf1失去对Bcl-2转录激活的作用。结论:1.顺铂处理能诱导Nrf1的表达。2.Nrf1抑制顺铂对MCF-7细胞诱导的凋亡。3.Nrf1上调Bcl-2,下调Caspase-3的m RNA及蛋白的表达。4.Nrf1降低MCF-7对顺铂的敏感性,抑制细胞凋亡的作用依赖于与Bcl-2启动子上的ARE作用激活Bcl-2的转录活性。