研究背景和目的恶性肿瘤是目前导致人类死亡的主要因素之一；各种恶性肿瘤既严重危害了患者的身心健康。同时,也给患者的家庭和社会带来无比沉重的经济负担。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,我国城市地区肝癌发病率约占恶性肿瘤总发病率的25%左右。目前,临床治疗肝细胞肝癌多采用肝移植、手术切除、介入治疗、射频消融、分子靶向(索拉非尼)及基因治疗等治疗手段,首选治疗方式为肝移植及手术切除。据各种对肝细胞肝癌治疗方法的相关文献显示：肝移植5年生存率为60%～80%,小肝癌切除5年生存率为50%～60%,大肝癌切除5年生存率为30%～40%,小肝癌消融疗法5年生存率为30%～40%。研究发现,无论哪种治疗方法的最终瓶颈均为术后的复发转移。由于肝脏血供丰富,血行转移是肝细胞肝癌治疗后的主要转移方式,有一大部分的肝癌患者,即使肿瘤体积很小,在手术之前就可能已经出现微血管的浸润或微小转移：即使在原发性肝癌肿瘤刚刚形成的生长早期,肿瘤细胞也可以从原发肿瘤脱落而进入到血液循环中,并在远处播散、种植,在特定的条件下,形成转移灶。当癌细胞侵入门静脉形成癌栓,癌栓在肝内脱落后则可以造成多发性转移病灶；同时,也可以经门静脉系统进入体循环,进而导致肝外转移。因此,肝细胞肝癌患者术后转移、复发已经成为影响肝癌患者预后的一个重要因素。如何监测、预防肝细胞肝癌患者术后转移复发,成为目前国内外学者研究的主要方向。目前临床上主要通过血清标志物、临床影像学检查等手段来对肿瘤进行检测、诊断、治疗和监测,但效果均不理想。临床上迫切需要找到一种能够有效监测肝癌转移的检测手段。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells CTCs)的研究已成为肿瘤复发转移领域研究的热点,国内外大量的临床试验证明,CTCs具有无创实时监测肿瘤的功能,能有效预测无进展生存期和总生存期,更利于对肿瘤微转移的检测以及预后评估。因此,CTCs可以应用于原发肿瘤的临床治疗、监测以及个体化治疗之中。CTCs是指自发或因诊疗操作由肿瘤原发病灶或者转移性病灶进入血液循环系统的肿瘤细胞,以单个细胞或细胞团的形式存在于循环系统中。早在1896年,澳大利亚学者Ashworth从一例转移性肿瘤患者血液中发现有一种血细胞与肿瘤细胞极为相似,并率先提出CTCs的概念。随后,CTCs逐步进入到了更多学者的视野。由于,CTCs多存在于各种肿瘤患者的外周循环之中,且在健康人群或其他非肿瘤疾病患者的外周循环之中几乎检测不到。从客观而言,CTCs的存在却并不一定提示机体内有转移性癌灶的形成,因为进入外周循环系统的绝大多数CTCs,会在机体的免疫作用下逐渐凋亡,仅有少数CTCs可以存活下来,并在肿瘤细胞生物学特性、机体免疫状况、宿主器官微环境等共同作用下,方能形成转移灶。由于CTCs具有与原发灶相似,甚至是相同性质的特征,故一些学者认为,可以将CTCs作为一种代表原发肿瘤的“液态活检标本”或“标记物”。随着近年来学界对CTCs在肿瘤转移进程中作用进行了系统而深入的研究后发现,若能采取有效方式对恶性肿瘤患者进行精准的外周血中的CTCs检测,则可以在进行有助于恶性肿瘤的早期诊断、治疗、复发、转移等的监测工作的同时,还可以对预后进行有效的预测;进一步更有助于治疗手段的科学选择与优化。通常,每毫升外周血含有1×107个左右的白细胞和5×109个左右的红细胞,相对于血细胞来说,存在于外周血中的肿瘤细胞数则非常少。如何富集和鉴定外周血中的肿瘤细胞成为CTCs检测最大的技术障碍。实际临床检测时发现,外周血中的CTCs存有量极少,且对其的精确分离也存在着一定的困难,因此也进一步限制了CTCs的应用及推广。直至20世纪90年代后期,随着现代生物科技的进一步发展以及学界对肿瘤研究的不断深入,CTCs的检测也得到了全面的发展。另外,由于原发肿瘤经临床治疗后可能存在的一些微小残留病变无法有效通过高分辨影像学检测技术进行检测,却可以通过高灵敏度和特异性的相关技术在患者的淋巴结、骨骼、血循环中检测出来；而外周血CTCs检测则可以无创下进行多次、重复性检查,这也为临床提供有效的肿瘤患者预后检测与管理。随着肿瘤的治疗已步入个体化治疗时代,很多肿瘤科医生需要依靠肿瘤分子或基因表型决定肿瘤的治疗,而CTCs检测技术的不断发展、进步,更多的学者开始充分利用其无创的“液态活组织”检查优势,进行转移癌的预后检测。方法本研究首次采用广州益善生物技术股份有限公司开发的CanPatrolTM TCs检测技术,选取2013年7月至2015年1月间南方医院肝胆外科收治的296例肝细胞肝癌患者为研究对象,并选择39例非肿瘤或良性肿瘤患者为对照组。所有受检者入院后第2天空腹采集外周血10m1；应用全血滤过富集技术检测患者外周血中的CTCs,分析其与患者性别、年龄、AFP水平、肝硬化、乙肝表面抗原、肿瘤数目、肿瘤大小、BCLC分期、TMN分期、分化程度、有无血管癌栓、有无肝内转移、肝外转移及有无复发等临床病理的关系；以进一步探讨CTCs检测在原发性肝癌临床诊治中的应用价值。该方法是运用RNA原位杂交和纳米过滤技术有机结合的原理,不需依赖特异生物标志物,据我们所知,这是目前唯一能同步实现CTCs形态分型、细胞分型和分子分型的先进检测技术。只需采集被检者5-10ml外周血,可在肿瘤治疗的任何阶段进行,能比其他常规检查手段更早、更准确地反映出肿瘤状态,且不会对被检者造成任何副作用。结果(1)肝细胞肝癌患者治疗术CTCs阳性病例数及CTCs计数分析。296例肝细胞肝癌患者CTCs阳性为211例,阳性率71.43%(211/296),CTCs数量分布于0-47个/5ml之间,中位值为14个/5ml,平均值为7.549±11.508个。对照组39例CTCs阳性为0例,阳性率为0%(0/39)。(2)127例手术患者检出CTCs阳性者89例,阳性率为70.07%,对检出的CTCs细胞进行分型检测,其中上皮型CTCs有52例,间质型CTCs有73例,上皮/间质混合型CTCs有70例。(3)CTCs数量与患者血清AFP水平、肿瘤BCLC分期、TMN分期、门静脉癌栓、微血管癌栓、肝内转移、肝外转移、术后复发有统计学相关(p<0.05);但与患者性别、年龄、有无肝硬化、乙肝表面抗原、肿瘤数目、肿瘤大小、肿瘤分化程度无关(P>0.05)。(4)手术患者术前CTCs检测结果阳性组(CTC≥3/5mL)术后肿瘤复发的风险显著高于CTCs阴性(总CTC<3)组,CTCs阳性组无瘤生存期较CTCs阴性组显著缩短(χ2=5.034,P=0.025)。结论(1)CanPatrolTM系统在肝细胞肝癌患者CTCs的检测中具有较高的敏感性和特异性。(2)CTCs数量与肝细胞肝癌患者AFP、BCLC分期、TNM分期、门静脉癌栓、肝内转移、远处转移、微血管癌栓和复发呈正相关。(3)手术前CTCs阳性的患者术后肿瘤复发的危险度较CTCs阴性的患者显著升高,无瘤生存时间较CTCs阴性的患者显著缩短。