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酿酒酵母这个具有代表性的真核生物模型,近年来在生物合成、生物发酵领域越来越受到人们的青睐。水杨酸是一种在工业上具有广泛应用的中间体,如何实现绿色生产具有极大的研究价值。本研究利用合成生物学的方法,在酿酒酵母中引入水杨酸合成基因,通过基因工程手段提高酿酒酵母中水杨酸的产量。具体工作如下:1、在酿酒酵母BY4741中引入外源基因entC和PfpchB,成功表达并催化反应生成水杨酸。优化启动子,改变外源基因表达,构建质粒181-PGI1-EP,181-TEF2-EP,181-TEF1-EP。重组菌BY4741-181-TEF1-EP,水杨酸产量最高达到12.06 ± 0.38 mg·L-1。2、对酿酒酵母莽草酸途径进行改造,解除关键酶Aro4的反馈抑制,并优化启动子构建质粒 181-PGI1-EPA,181-TEF2-EPA,181-TEF1-EPA。重组酿酒酵母BY4741-181-TEF1-EPA水杨酸发酵产量最高达到33.2±0.3 mg·L-1。整合替换Aro1基因启动子为TEF1p,重组菌BY4741-TEF1p-Aro1-181-TEF1-EPA 水杨酸发酵产量为 7.76±0.41 mg·L-1。3、在酿酒酵母中异源表达大肠杆菌莽草酸途径相关酶,分三个模块构建质粒:模块一 181-TEF1-EPAC,195-AroC;模块二 195-AL;模块三195-BDE;模块二模块三联合构建195-ALBDE。其中模块三发酵48 h水杨酸产量最高为41.68 ± 1.92 mg·L-1。4、在酿酒酵母中,过表达磷酸戊糖途径上的基因,构建了单基因过表达质粒195-ZWF1,195-SOL3,195-GND1,195-TKL1,195-TAL1,和多基因过表达质粒 195-ZWF1-SOL3, 195-SOL3-GND1 ,195-ZWF1-GND1,195-TKL1-TAL1,195-ZWF1-SOL3-GND1。单基因过表达GND1水杨酸产量最高46.71 ± 0.27 mg·L-1。多基因过表达中,ZWF1和GND1共表达产量最高,为46.15±0.80mg·L-1。