目的:杂色曲霉素(sterigmatocystin, ST)是杂色曲霉、构巢曲霉等真菌产生的有毒代谢产物,在人类食品及动物饲料中其污染普遍存在,是一种具有致突变、致癌性的真菌毒素。针对ST在我国胃癌高发区居民粮食中存在的高污染状况,我们对ST的作用进行了系列的研究工作,以期揭示其高污染状况与肿瘤高发之间的相关性。研究结果表明,ST处理可引起体外培养的人胚肺和胃粘膜细胞p53第八外显子和Ki-ras基因的突变;经口灌喂ST可诱发小鼠肺腺癌发生和腺胃粘膜发生异型增生,提示ST具有一定的致癌性和致突变性。同时还发现ST对小鼠和人免疫细胞功能具有明显的影响,表现在ST可抑制小鼠脾细胞IL-2和IFN-γ的表达;抑制小鼠腹腔巨噬细胞IL-12的表达;诱导人外周血淋巴细胞发生凋亡并抑制其IL-2的分泌;降低人外周血单个核细胞表面HLA-I分子的表达、抑制TAP1基因表达等,上述结果提示ST暴露可对机体的免疫功能发挥一定的负面影响。机体的免疫监视功能在肿瘤的发生及发展过程中发挥着非常重要的作用。其中人类白细胞抗原-I (human leukocyte antigen-I, HLA-I)是机体免疫监视功能相关的重要分子。HLA-I分子分布于所有有核细胞表面,可与内源性抗原肽结合,并将其提呈给CD8+ T淋巴细胞诱发特异性细胞杀伤效应,在机体抗病毒感染、监视和清除体内突变细胞过程中起着重要的作用。在HLA-I分子的组装、成熟、向细胞表面的转运以及对T淋巴细胞的抗原提呈等过程中,细胞内质网膜上的TAP分子(TAP1和TAP2两个亚基组成)起着关键作用。TAP基因缺失的细胞株中,HLA-I分子的组装、成熟以及转运等生物合成功能方面明显低于正常细胞株。将TAP基因转染低表达TAP的肿瘤细胞,可使细胞表面HLA-I分子的表达明显增加,同时使CTL(细胞毒性T淋巴细胞)对肿瘤细胞的敏感性相应地增加。这些结果提示TAP表达与HLA-I分子表达以及CTL杀伤功能密切相关,TAP和HLA-I分子表达的降低或缺失有利于细胞逃避机体的免疫监视作用。TAP和HLA-I分子表达降低或缺失可见于人类许多肿瘤细胞中,如小细胞肺癌、宫颈癌、肾细胞癌、黑色素瘤、食管癌、白血病以及星形细胞瘤等,并且其表达与肿瘤的分级、分期、淋巴结转移、肿瘤组织中CD3+/CD8+淋巴细胞的浸润以及患者的预后密切相关。此外,一些具有致癌性的环境因素可以引起非肿瘤细胞中TAP以及HLA-I分子表达的抑制,如伏马菌素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及烟叶提取物等,细胞表面HLA-I表达的降低有助于细胞逃避免疫监视,使低表达HLA-I的细胞发生癌变成为可能。我们前期研究发现,ST可抑制人外周血单个核细胞表面HLA-I分子以及TAP1的表达,同时发现ST可降低体外培养的正常人食管上皮细胞表面HLA-I分子表达。鉴于HLA-I的正常表达在维持免疫监视中的重要作用,并针对ST在我国胃癌高发区居民粮食中存在的高污染状况,本研究中我们以体外培养的人胃粘膜上皮细胞(GES-1)作为研究对象,观察了ST对细胞表面HLA-I分子以及TAP1表达的影响;并进一步构建TAP1真核表达质粒转染GES-1细胞,对杂色曲霉素引起HLA-I分子改变的机制进行了探讨。以期从机体免疫监视方面探讨杂色曲霉素可能的致癌作用,并为今后研究TAP1基因在肿瘤发生发展中的作用以及肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法:1细胞培养及处理1.1正常人胃粘膜上皮细胞株GES-1细胞培养用含10%胎牛血清、105 U/L青霉素以及100mg/L链霉素的DMEM培养基于37℃,5% CO2温箱中体外培养正常人胃粘膜上皮细胞株GES-1细胞,细胞呈贴壁生长。选择对数生长期的细胞(传代后24h)随机分为空白对照组、溶剂对照组和各个实验组。实验组分别给予DMSO溶解并经生理盐水稀释的ST,使其终浓度分别为100μg/L、500μg/L、1000μg/L和2000μg/L,对照组给予等体积的生理盐水,溶剂对照组给予等体积DMSO溶液,于实验处理相应的时间后收集细胞进行相关指标检测。1.2人外周静脉血单个核细胞的分离与培养采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法(ficoll -hypaque density gradientcentrifugation)分离人外周静脉血单个核细胞,于含10%胎牛血清、105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基中进行培养,加入PHA至终浓度300μg/mL。培养48h收集细胞,提取细胞总RNA用于获得人全长TAP1基因,构建TAP1真核表达质粒。2半定量RT-PCR法2.1细胞总RNA的提取、鉴定及定量采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。1%琼脂糖电泳鉴定其完整性,并经紫外分光光度计进行定量和纯度检测。2.2反转录以及PCR反应取2μg总RNA经逆转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR反应。所用引物序列如下:TAP1 Sense: 5’-GCTCAGCCGATACCTTCA-3’; Anti-sense: 5’-CCACTTTCAGCAGCATACC-3’. HLA-A Sense: 5’-CCTACG ACGGCAAGGATTACA-3’; Anti-sense: 5’-ACATCACGGCAG CGACCA -3’. HLA-B Sense:5’-CTACGACGGCAAGGATTAC-3’; 5’-GGTGGACT GGGAAGACG-3’. HLA-C Sense: 5’-GCAGTTCGTGCGGTTCG-3’; 5’-GT CTCCTTCCCGTTCTCC-3’.β2m Sense: 5’-TCAT CCATCCGACATTG-3’; Anti-sense 5’-GCAGGCATACTCATCTTTT-3’. GADPH Sense: 5’-GGA AGGTGAAGGTCGGAGT-3’; Anti-sense: 5’-CCTGGAAGATGGTGA TGG G-3’.采用凝胶分析软件(BIO-LD)进行定量分析,各组以目的基因与内参照基因GAPDH量的比值来表示目的基因的相对表达量。本研究中采用此方法检测不同浓度ST处理后,GES-1细胞内HLA-I重链(HLA-A,HLA-B, HLA-C)、β2m链和TAP1在mRNA水平表达的影响。3蛋白免疫印迹(Western Blot)提取细胞总蛋白,经15 % SDS-PAGE电泳,电转移于PVDF膜上,5 %脱脂奶37℃封闭2h。一抗(1:200)4 oC过夜,二抗(1:2000)37 oC温育2 h,ECL显色。Snygene全自动凝胶成像分析系统分析蛋白的表达,以β-肌动蛋白表达作为内参照,以TAP1、HLA-I与β-肌动蛋白的比值分别表示其相对表达量。4 TAP1真核表达质粒的构建4.1质粒构建:以人外周血单个核细胞总RNA为模板,经RT-PCR反应获得人全长TAP1基因,以pcDNA3.1/V5-His B为载体,经酶切、连接、转化等基因重组技术,构建含人TAP1基因全长的pcDNA3.1/V5-His- TAP1质粒。所获得的质粒经PCR鉴定和酶切鉴定,初步证实为阳性重组载体。4.2测序由Takara公司提供测序服务,结果与Genebank序列(L21204)公布的人TAP1全长cDNA序列比较证实其序列的准确性。5细胞转染转染前一天,将处于对数生长期的GES-1细胞接种于6孔板内,于不含血清的培养基中培养,细胞密度为60 %～80 %,第二天进行细胞转染。细胞分为空白对照组、pcDNA3.1空质粒组(空质粒组)和pcDNA3.1/V5-His-TAP1质粒组(TAP1质粒组)。根据lipofectamineTM 2000的试剂说明瞬时转染GES-1细胞。转染6小时后更换含有血清的培养基继续培养24h。收集细胞经RT-PCR、Western blot和FCM检测转染后TAP1、HLA-I的表达情况,观察构建的质粒在GES-1细胞中的转染效率。GES-1细胞预先经1000μg/L的ST预处理24h后进行转染。细胞分为ST+空质粒组和ST+ TAP1质粒组。转染后24h收集细胞,经RT-PCR、Western blot观察转染TAP1对ST处理GES-1细胞的HLA-I表达的影响。6统计学分析所有数据采用SPSS13.0软件进行两样本T检验与单因素方差分析(analysis of variance, ANOVA),结果用x±s表示。结果:第一部分:杂色曲霉素对体外培养的GES-1细胞HLA-I及其抗原加工转运相关分子TAP1表达的影响1 ST对GES-1细胞HLA-I分子表达的影响1.1 ST对GES-1细胞HLA-I重链HLA-A,B,C mRNA表达的影响RT-PCR检测结果表明:与对照组相比,在ST 100~2000μg/L浓度范围内,HLA-A、HLA-B以及HLA-C mRNA的表达水平随处理浓度的增加呈下降趋势。在1000μg/L和2000μg/L ST处理组中,HLA-A、HLA-B mRNA表达降低最明显(p<0.05)。HLA-C mRNA在2000μg/LST处理组的表达量也明显降低(p<0.05)。1.2 ST对GES-1细胞HLA-I分子β2m链mRNA表达的影响RT-PCR结果显示:各浓度ST处理组β2m mRNA的表达量改变与对照组水平相比均无明显统计学意义。1.3蛋白免疫印迹检测HLA-I蛋白的表达HLA-I蛋白分子量为43~45KD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,GES-1细胞空白对照组、溶剂对照组、以及各ST处理组均在正确的位置出现了阳性条带。以β-actin (42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析表明,不同浓度ST处理可以使GES-1细胞HLA-I蛋白的表达降低,尤其在1000μg/L和2000μg/L的ST处理组中降低最显著(p<0.05)。2 ST对GES-1细胞TAP1表达的影响2.1 ST对GES-1细胞TAP1 mRNA表达的影响ST 100μg/L和500μg/L处理组中,GES-1细胞TAP1 mRNA表达与对照组相比无明显变化,但是在1000μg/L、2000μg/L的ST处理组细胞中,其表达水平显著下降(p<0.05)。2.2蛋白免疫印迹检测TAP1蛋白的表达TAP1蛋白分子量为74KD,以β-actin(42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析。分析结果表明,ST处理可以不同程度的降低GES-1细胞内TAP1蛋白的表达,并且以ST 1000μg/L和2000μg/L处理组细胞中TAP1的降低最显著(p<0.05)。第二部分:TAP1基因转染对杂色曲霉素引起的GES-1细胞HLA-I分子表达影响的机制研究1 TAP1 cDNA扩增及真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TAP1的构建提取人外周血单个核细胞总RNA,RT-PCR产物经2%琼脂糖电泳可见2247bpTAP1特异目的条带,产物长度与所设计相同。纯化的PCR产物以及载体pcDNA3.1/V5-His B分别经EcoR I和Xho I双酶切,产物纯化后连接过夜,取连接产物5μl,转化DH5α感受态细胞,菌液涂布含有Amp抗性的平板,37℃培养20h以上,挑取克隆经PCR鉴定和酶切鉴定,初步证实为阳性重组载体。进一步经公司测序鉴定,并与Genebank序列(L21204)公布的人TAP1全长cDNA序列比较证实其序列的准确性。结果证实我们成功构建了含人TAP1基因全长的pcDNA3.1/V5-His- TAP1真核表达载体。2 TAP1瞬时转染GES-1细胞及其转染效率检测应用所构建的TAP1质粒转染GES-1细胞,24h后收集细胞并观察TAP1基因的表达情况。RT-PCR证实,在618bp处有TAP1特异性扩增产物条带存在。与空载体组相比,pcDNA3.1/V5-His-TAP1转染组细胞TAP1基因表达明显增高。western blot检测结果同时表明,TAP1转染组细胞TAP1蛋白的表达明显高于未转染组和空质粒组。上述结果表明GES-1细胞适于所构建的TAP1质粒的转染,转染后TAP1基因表达显著增加。3 TAP1基因转染对ST预处理的GES-1细胞HLA-I分子表达的作用3.1 TAP1转染对GES-1细胞HLA-I分子的表达的影响首先在未给予ST处理的GES-1细胞中观察了TAP1转染对HLA-I分子表达的影响。Western blot检测结果显示: GES-1细胞内HLA-I蛋白表达量在未转染组和空质粒组细胞中的表达没有明显差异,而在TAP1质粒组HLA-I蛋白表达量明显高于未转染组和空质粒组(p<0.05)。同时,RT-PCR检测结果表明未转染组与空质粒组细胞HLA-A、HLA-B、HLA-C以及β2m mRNA的表达均未见明显差别。与未转染组、空质粒组相比,TAP1质粒组GES-1细胞中HLA-A, HLA-B以及HLA-C mRNA的表达显著增加(p<0.05),而β2m mRNA的表达则无明显变化。检测结果表明转染TAP1质粒后可增加GES-1细胞HLA-I分子的表达。3.2 TAP1转染ST预处理的GES-1细胞对其HLA-I分子的表达的影响基于上述的研究结果,我们只以ST 1000μg/L对GES-1细胞进行预处理,于ST作用24h后进行细胞转染。细胞分为两组:ST+空质粒组和ST+TAP1质粒组。Western blot检测结果显示,ST+TAP1质粒组GES-1细胞内HLA-I蛋白表达量明显高于ST+空质粒组,并且细胞HLA-A, HLA-B及HLA-C mRNA的表达量在TAP1质粒组均明显增加(p<0.05),但β2m mRNA的表达则无明显变化。结论:1给予GES-1细胞不同浓度ST处理,可不同程度地抑制细胞HLA-I分子在mRNA和蛋白水平的表达,以1000μg/L和2000μg/L的ST作用最为显著。2 1000μg/L和2000μg/LST处理GES-1细胞,可明显降低GES-1细胞内TAP1分子在mRNA和蛋白水平的表达。3成功构建了人TAP1真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TAP1。将其转染GES-1细胞显示较高的转染效率,可用于TAP1功能研究。4 TAP1基因瞬时转染GES-1细胞能够上调细胞表面HLA-I分子的表达。5 TAP1转染可以逆转ST对GES-1细胞HLA-I分子表达的抑制作用,表明ST引起的TAP1基因表达的抑制是引起细胞表面HLA-I分子表达降低的机制之一。