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伤寒沙门菌(salmonella typhi,S.typhi)是重要的肠道致病菌,属胞内寄生菌,它可引起伤寒等严重疾病。巨噬细胞是人体主要的吞噬细胞,它在许多病原体的清除和破坏中起重要作用。伤寒沙门菌在巨噬细胞内生存、增殖的能力与其致病性密切相关。近来研究发现伤寒沙门菌感染后可导致巨噬细胞异常凋亡,从而逃脱机体天然免疫系统的识别。但伤寒沙门菌引起细胞凋亡的确切机制及环境条件对细胞凋亡的影响还有待于进一步研究。其中就包括伤寒沙门菌被巨噬细胞吞噬后所遭遇的细胞内的氧化应激环境。本课题拟用H2O2刺激伤寒沙门菌的生长以模拟体内的氧化条件,用人白血病细胞系THP-1细胞经PMA分化的巨噬细胞为模型,探讨伤寒沙门菌及其氧化条件下对巨噬细胞凋亡的影响,以深入了解伤寒沙门菌的致病机制。 用伤寒沙门菌及其氧化菌分别感染PMA分化的THP-1细胞,同时设立空白对照,于作用后2,6,12,24小时终止培养, Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测显示伤寒沙门菌及其氧化菌诱导巨噬细胞凋亡率与对照组相比明显增高(P<0.01);伤寒沙门菌氧化组与伤寒沙门菌相比,巨噬细胞在2h,6h和8h时间段的凋亡率明显增高(P<0.05);随作用时间的延长,在前12h内各组巨噬细胞的凋亡率逐渐增加(P<0.05)。苔盼蓝染色进行活细胞记数显示随感染时间的延长,各实验组染成兰色的坏死细胞增多(P<0.05),对照组不受影响。 采用同样的方法感染THP-1细胞,同时设立正常对照,于作用后6小时终止培养。硫代巴比妥酸法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA),结果显示:伤寒沙门菌氧化组与伤寒沙门菌诱导巨噬细胞产生丙二醛与对照组相比明显增高(P<0.05);伤寒沙门菌氧化组与伤寒沙门菌相比,巨噬细胞产生丙二醛明显增高(P<0.05)。黄嘌呤氧化酶法检测超氧化歧化酶(superoxide dismutase,SOD),结果显示:伤寒沙门菌氧化组与伤寒沙门菌诱导巨噬细胞产生超氧化歧化酶与对照组相比明显降低(P<0.05);伤寒沙门菌氧化组与伤寒沙门菌相比,巨噬细胞产生超氧化歧化酶明显降低(P<0.05)。硝酸还原酶法和ELISA法分别检测培养液中一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度变化,结果显示伤寒沙门菌氧化组与伤寒沙门菌组NO和TNF-α浓度较对照组明显升高(P<0.05),而且在巨噬细胞凋亡高峰时维持较高水平。 四甲基噻唑氮蓝(MTT)法检测细胞活力,结果显示:伤寒沙门菌氧化组与伤寒沙门菌相比,巨噬细胞活力明显降低(P<0.05)。 用anti-TNF-α抗体阻断TNF-α后6小时Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测检测巨噬细胞凋亡率,结果显示伤寒沙门菌氧化组与伤寒沙门菌组凋亡率明显降低。提示NO和TNF-α在巨噬细胞凋亡中发挥一定作用。实验说明伤寒沙门菌及其氧化菌可通过诱导巨噬细胞异常凋亡,损伤宿主免疫功能,发挥致病作用,而伤寒沙门菌经氧化诱导后有更强的毒性,这对于我们更好的了解伤寒沙门菌的致病性提供了参考。