论文部分内容阅读
CD3是猪T细胞的重要表面分子，由γ、δ、ε、η、ζ五种多肽链组成。本研究采用RT-PCR方法从猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出CD3ε基因，成功构建了表达猪CD3ε的和稳定表达细胞系；以原核表达的CD3ε重组蛋白作为免疫原，利用重组腺病毒和稳定表达细胞系筛选到5株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，为猪传染病的免疫评价和致病机理研究奠定了物质基础。
利用巢式PCR方法从猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出包括CD3ε全长基因的641bp基因片段并插入腺病毒穿梭载体构建出穿梭质粒pDC316-CD3ε，与腺病毒辅助质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒Adv-CD3ε。该重组腺病毒可在293细胞中稳定传代，Adv-CD3ε感染的BHK-21细胞可被CD3ε抗体所识别。将扩增出的CD3ε基因片段插入真核表达载体构建出真核表达质粒pcDNA3.1-CD3ε，转染BHK-21细胞后用G418进行加压筛选得到稳定表达猪CD3ε的BHK-21细胞，经克隆扩大培养后得到稳定表达并可被CD3ε抗体所识别的细胞系。
利用原核表达的CD3ε重组蛋白免疫8周龄Balb/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用基于CD3ε重组蛋白的间接ELISA和构建的重组腺病毒与稳定细胞系进行间接免疫荧光试验筛选阳性孔。采用有限稀释法对刚性孔进行3次克隆，最终获得5株稳定分泌抗猪CD3ε的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，分别命名为AB、BF、CA、DG、GF。间接ELISA检测单抗腹水效价，结果表明AB、DG、GF的效价达1:810000以上，BF、CA的效价达1:2430000以上，5株抗体均为IgG2b亚类，轻链型为κ；免疫印迹试验证明5株单克隆抗体均能识别CD3ε重组蛋白；5株单克隆抗体识别同一抗原表位；猪外周血的流式细胞术分析结果表明，CD3ε阳性细胞的比例65％～70％。