研究背景及目的先天性尿道下裂以及尿道外伤、肿瘤、尿道狭窄等疾病的发生目前有逐年增高趋势,其有效解决办法还依赖于外科手术治疗。传统的外科手术处理,多应用自身包皮、阴囊组织原位修复,或者应用颊粘膜、膀胱粘膜等自体组织移植修复处理。但明显的缺陷就是容易并发术后尿道瘘、尿道再狭窄、尿道结石等,且对于再次手术、尿道缺损较长的病例,容易因自身修复材料不足而令临床医生产生治疗上的无奈。随着医学技术和相关学科的发展,组织工程学首先在骨科及皮肤科等领域出现并取得了一定的研究进展。这也为目前面临的尿道修复材料来源难题提供了一种全新的解决思路。目前国内外学者已经进行了该领域的实验性研究及少部分临床应用的尝试,取得了一定成就,也不同程度地暴露出了一些问题和弊端。特别是在种子细胞的选择方面,仍存在不少争议。研究发现,骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化潜能,可定向分化为外胚层的神经元和神经胶质细胞、中胚层的成骨细胞和脂肪细胞、内胚层的肝细胞等。BMSCs具备与ECM的良好生物相容性,在组织工程研究中得到了广泛的应用,并首先在组织工程骨组织的构建试验中取得了很大的成功。另有研究证实,干细胞与尿道上皮细胞的直接接触可以诱导其向尿路上皮定向分化,但具体机制尚不明确。BMSCs的体外分离与培养主要采用以下几种方式:(1)贴壁筛选法;(2)密度梯度离心法;(3)免疫磁珠筛选法;(4)流式细胞仪分选法。尿路上皮细胞是较难培养的上皮细胞之一,既往人们曾经认为尿路上皮细胞会自然衰老凋亡,正常的尿路上皮细胞可以在体外存活,但时间短,很难在体外培养、传代,且无证据表明细胞有数量的增加。随着细胞培养技术的不断完善和细胞培养条件的优化,尿路上皮细胞的培养研究逐步展开并不断获得成功。动物实验表明,膀胱来源的尿路上皮细胞可在体外培养传代至3~12代。国外的研究随后证实,人膀胱移行上皮细胞的体外培养方面的研究也获得了成功。膀胱来源的尿路上皮细胞的分离方法有酶消化法、组织块法及刮削法3种。本实验拟通过应用干细胞(骨髓间充质干细胞)和成体细胞(尿路上皮细胞)联合脱细胞基质材料的体外培养,并应用于长段尿道缺损的修复研究。通过比较实验结果,以期寻找更为理想的种子细胞,进一步推动尿道组织工程的发展。方法1.种子细胞的制备、筛选及鉴定1.1骨髓间充质干细胞的制备、筛选与鉴定选取雄性新西兰白兔为实验对象,抽取双下肢骨髓,利用密度梯度离心法分离提取骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增、传代。应用流式细胞仪检测细胞表面CD34、CD44的表达,鉴定确认为骨髓间充质干细胞。将其作为实验用种子细胞之一。1.2尿路上皮细胞的制备、筛选与鉴定以雄性新西兰白兔为实验动物,机械分离法及酶消化法分离提取膀胱黏膜组织中的尿路上皮细胞,进行体外培养、传代。应用免疫荧光法鉴定尿路上皮细胞表面特异性表达因子及标记物——细胞角蛋白-18(CK-18)与和尿溶蛋白-2(UP2)的表达水平,鉴定确认尿路上皮细胞,并作为另外一种实验用种子细胞。2.种子细胞—脱细胞基质材料的复合培养与标记2.1骨髓间充质干细胞(BMSC)—脱细胞基质的制备选取培养传代后已接近90%融合的第4代BMSC,加入含有0.2%5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)的无血清低糖DMEM溶液培养标记,然后应用移液器将制备好的细胞悬液均匀滴加到脱细胞基质粘膜面。联合培养制备复合材料备用。2.2尿路上皮细胞—脱细胞基质的制备选取传代培养后已接近90%融合的第4代尿路上皮细胞备用,0.2%5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)共同培养标记。应用移液器将制备好的细胞悬液均匀滴加到脱细胞基质粘膜面,联合培养制备复合材料备用。3.尿道缺损模型的制作与修复3.1尿道缺损模型的制作全麻下游离雄性新西兰白兔尿道,切除中段尿道长约3cm,人工制作尿道缺损动物模型,备用。3.2尿道缺损的修复56只雄性成年新西兰兔,应用随机数字法分组,分为4组,每组14只。具体分组及修复操作如下:A组(无细胞对照组)即:单纯应用异种脱细胞基质修复组。应用空白脱细胞基质材料直接制作管状尿道,用于尿道缺损模型的尿道修复与重建;B组(假手术组)即:假手术对照组。尿道缺损模型制作成功后,将尿道缺损后的两个尿道断端直接行端端吻合,恢复尿道连续性;C组(BMSCs组)即:BMSC复合异种脱细胞基质手术修复组。将BMSCs联合脱细胞基质材料联合培养后,用于尿道缺损模型的尿道修复与重建,作为实验组之一;D组(尿路上皮细胞组)即:为尿路上皮细胞复合脱细胞基质手术修复组。将尿路上皮细胞联合脱细胞基质材料联合培养后,用于尿道缺损模型的尿道修复与重建,作为另一实验组。结果1.BMSCs呈贴壁式生长,由短梭形逐渐演变为长梭形外观。应用流式细胞仪检测传代至第4代的BMSC,可见其表达CD44阳性,而CD34的表达则为阴性,符合间充质干细胞特征;2.尿路上皮细胞呈贴壁式生长,呈圆形、类圆形外观,逐渐融合形成铺路石样外观。免疫荧光实验结果显示所培养的细胞表达CK-18与UP2呈阳性;3.BMSCs及尿路上皮细胞接种后脱细胞基质材料透明度降低,细胞均呈集落样生长,形成网状结构。4.四组试验动物均全部存活,B组修复后恢复最为顺利,A组修复效果最差,C、D组实验动物观察至术后12周修复效果相当,经统计学检验处理,两组差异无统计学意义。结论1.成功分离获得BMSCs,操作简单且来源丰富,可作为尿道组织工程种子细胞备选;2.成功分离获得尿路上皮细胞,细胞数量多,浓度高,可作为尿道组织工程种子细胞备选;3.BMSCs及尿路上皮细胞均能在脱细胞基质材料上贴附生长,形成立体网状结构,可以作为尿道缺损替代修复材料;4.`BMSCs和尿路上皮细胞均可作为种子细胞应用于组织工程化尿道的构建和长段尿道缺损的修复。