1982年美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场,标志着第一个重组蛋白类药物的诞生。蛋白大分子药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用等特点,20多年来,蛋白大分子药物产业蓬勃发展,全球生物技术公司总数5000多家,销售总额超过400亿美元,其中生物技术药物占总销售额的70％。然而,蛋白大分子口服吸收率低、体内半衰期短,需采取的频繁注射的给药方式,显著地降低病人的顺应性,并且,越来越不能满足治疗的需要。　　 技术上,蛋白大分子的缓释在两个领域具有关键性的作用:(1)治疗慢性疾病方面:使用蛋白大分子给药的病人,通常需要长期给药,甚至终身给药,如:肿瘤病人、糖尿病人等,一周三次甚至一天一次的常规注射给药方式,极大的增加了病人的痛苦；(2)干细胞治疗方面:组织修复时,为了使干细胞增值分化相关的细胞因子能够在修复部位保持足够的时间和浓度以确保干细胞的分化增值(目前市场上的水针或者粉针制剂,无法达到局部维持的作用),关系到干细胞技术用于组织再生治疗的成败。如此急切的技术需求和广阔的市场前景,使得科学家在这个领域力求取得技术性突破。理想的缓释剂型的技术特征:(1)有效的保护蛋白的活性,减少变性和聚集；(2)减小突释,将其控制在合理的范围内；(3)减少不完全释放；(4)使用的缓释材料和治疗方式,需得到安全认证；(5)体内实现长效的药效指标；(5)减少体内的免疫等副反应。然而,蛋白大分子的高级结构在制备缓释体系以及体内释放过程中容易发生变性和聚集,成为难以攻克的技术壁垒,至今仍未有成功的天然结构的蛋白大分子缓释产品问世。　　 选择促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)这样一个结构敏感、极容易产生聚集并且造成体内不良免疫反应(纯红细胞再生障碍性贫血,antibody—mediatedpure red cell aplasia,PRCA)的蛋白大分子药物实现安全高效的缓释,具有非常高的技术挑战。促红细胞生成素在治疗慢性疾病方面具有广泛的应用,美国食品药品管理局(Food and Drug Admistraton,FDA)批准EPO用于治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血、癌症化疗引起的贫血以及获得性免疫缺陷病人的贫血,并且,EPO在组织再生、保护神经细胞、治疗心衰等方面都具有重要的开发前景。促红细胞生成素是重组蛋白类药物销售额最高的产品,2006年的销售额达到126亿美元。更为重要的是,该分子的天然构象对外界苛刻环境敏感,极易于变性和聚集,由贫血治疗分子变为导致贫血分子。　　 本研究的思路是:　　 (1)在温和的条件下将结构脆弱的蛋白制备成对苛刻条件耐受的蛋白多糖颗粒,在微球制备过程中实现对蛋白的保护作用；　　 (2)在释放过程中,多糖颗粒对蛋白发挥保护作用,同时改善蛋白的释放动力学；　　 (3)采用适宜的微球制备方法(结合蛋白多糖颗粒)以达到具体的体内缓释要求；　　 (4)制备的剂型具有体内3周以上的药效,同时避免体内的不良免疫反应,主要是抗体反应。　　 本研究是基于水相水相乳液系统,在温和条件下,选择合适的乳液稳定方法,将结构脆弱的蛋白大分子制各成对有机溶剂和其他苛刻条件有高度耐受的1μm-5μm多糖颗粒。然后,进一步采用适宜的微球制备方法(考虑到释放行为和聚集情况的因素),将EPO多糖颗粒包裹于生物可降解的聚乳酸羟基乙酸(PLGA)中,制成粒径小于100μm的EPO复合式缓释微球。进一步对制备的包裹EPO多糖颗粒的PLGA复合式微球进行体内药效和诱导抗体情况的检测,对其有效性和安全性进行评估。　　 1.本研究提供一种方法-水相水相乳液系统(包括稳定水水乳液,低温水水乳液和低温诱导相分离方法),在蛋白接触有机溶剂之前,将其制备成固态颗粒。稳定的高分子水相-水相乳液是一个新型的材料体系,它以分散相(多糖相)和连续相(聚乙二醇相)都是水相的特点区别于常规的水/油、油/水乳液。两个水溶液通过增加其溶质的分子量或者降低温度,从而达到两者不互溶的状态。通过对溶质的选择,蛋白分子可以自主的,具有绝对优势地分配在分散相中。由于两者都是水相,新型乳液中分散相和连续相之间的界面张力极低,保证了蛋白分子构象不会受到界面张力的影响。从颗粒粒径分布、表面形态以及被包裹促红细胞生成素的聚集方面分析,低温诱导的相分离的方法更适用于促红细胞生成素。这种颗粒的制备关键是在温和的条件下:　　 (1)不接触活性催化剂；　　 (2)不接触油水界面；　　 (3)不接触气液界面；　　 (4)在水相的环境中,将其制备成蛋白多糖颗粒。　　 2.在大量的实验基础上(BSA微球释放行为预优化和EPO微球聚集情况的分析),建立了适合EPO缓释的微球制作方法-利用S-O-W方法制备的包裹EPO多糖颗粒的PLGA复合式缓释微球,符合目前缓释体系的体外标准:　　 (1)聚集小于2％(中国药典对EPO水针剂的要求是主峰面积不小于98％)；　　 (2)突释小于20％(通常认为的可接受的比例)；　　 (3)具有合适的包封率；　　 (4)良好的外观和合适的粒径(注射针头的直径小可以提高病人的顺应性)。　　 蛋白多糖颗粒在制备过程中减少蛋白的可动性,同时保护蛋白免于和疏水性高分子以及油水界面等引起蛋白失活的因素的直接接触,从而在制备过程中保护了蛋白；在释放过程中,多糖颗粒慢慢水合,形成凝胶状物质,从而提供亲水性环境,阻止了蛋白吸附于疏水性生物可降解高分子PLGA表面而变性失活,减小了发生聚集的机会。同时,多糖颗粒提供了亲水通道,增加了微球的通透性,提高了小分子的通透性,避免了PLGA降解产生的酸在微球内部沉积,减少了蛋白的失活,改善了不完全释放情况,同时调节了微球中蛋白的释放行为。　　 3.在促进红细胞生成的方面,一月一次注射的缓释微球(S-O-W方法制备的包裹EPO葡聚糖颗粒的PLGA复合式微球)可以达到12针水针剂(连续四周一周三针)在BALB/C小鼠体内的药效。并且,红细胞水平和给药剂量在一定的范围内具有线性相关性,在微球给药时,可以结合病人的病情需要,给予合适的剂量。同时,实验证明通过调整微球的配方组成,可以微调微球的释药行为,便于个性化给药。　　 4.在研究将EPO多糖颗粒进一步包封的过程中,创造性的使用完全无水系统(S-O-hO-O)制备包裹EPO多糖颗粒的PLGA缓释微球。使用甘油和1,2丙二醇的混和液作为连续相,减少了连续相和有机溶液(用来溶解疏水性高分子)之间的界面张力,在完全无水的环境中对促红细胞生成素进行包封,使其天然构象得到了很好的保护,突破性地实现在简单的操作条件下(相对于其他使用液氮、需要喷雾的硫酸铵沉淀等方法)和安全的温和环境中(相对于使用大量棉子油和石油醚等有机溶剂的传统的完全无水法等方法),制备无聚集的EPO缓释微球。　　 5.在促进红细胞生成的方面,一月一次注射的缓释微球(S-O-hO-O方法制备的包裹EPO-葡聚糖颗粒的PLGA缓释微球)体内药效情况还未达到12针水针剂(连续四周一周三针)在BALB/C小鼠体内的药效情况(分析应由突释较大引起的)。但是,鉴于其简单的制备过程和温和的制备环境等明显优势以及显著地减小制备过程的蛋白聚集情况(详见第三章),在完全无水的思路指导下,通过选择合适的表面活性剂或者调节完全无水的连续相的组成和比例,进一步改善配方,有望在这个领域实现突破。　　 6.初步抗体实验表明,小鼠体内微球制剂(包括S-O-W方法制备的包裹EPO葡聚糖颗粒的PLGA复合式微球和S-O-hO-O方法制备的包裹EPO-葡聚糖颗粒的PLGA复合式缓释微球)引起的抗体量和EPO水针制剂的抗体量相当。复乳法会引起一定的免疫反应。这一点在蛋白缓释,尤其是EPO缓释剂型的设计中具有重要的意义。　　 7.目前没有明确的蛋白大分子缓释制剂的质量标准,鉴于促红细胞生成素结构脆弱、研究难度大以及药物本身价格昂贵,所作的相关研究更是很少,建立合理的质量标准非常重要。在节约检测成本和制定可行的检测标准的考虑下,建议以下检测指标作为商品化产品的质量标准:微球的粒径(决定体内的分布和注射器的规格)；微球的担载量(决定给药剂量)；微球中回收的蛋白的聚集情况分析；至少考察第一天的释放量；本实验使用流式细胞仪检测网织红细胞和血细胞计数仪检测红细胞相结合的方法考察EPO缓释微球对贫血的治疗效果,有效可行。　　 本研究制备的包裹促红细胞生成素多糖颗粒的复合式缓释微球具备理想缓释制剂的基本特征,具有重要的意义:(1)意味着一个重要的治疗类蛋白药物在蛋白大分子缓释领域取得突破性的进展；(2)促红细胞生成素这样一个结构敏感、极容易产生聚集并且造成不良免疫反应的蛋白大分子药物能够安全地实现缓释,具有推广到其他蛋白大分子上的巨大潜力。