论文部分内容阅读
目的:本实验通过建立UVA诱导的人成纤维细胞光老化模型,采用原代细胞培养、免疫荧光技术、流式细胞术、分子生物学等技术及方法,检测人皮肤成纤维细胞体外増殖活性、细胞内活性氧类总量,检测人皮肤成纤维细胞P38丝裂原活化蛋白激酶、c-jun氨基端激酶、基质金属蛋白酶-1的m RNA及蛋白表达;探讨CGF在UVA诱导的HDFs光老化中的作用及机制。方法:1. 人皮肤成纤维细胞原代培养及鉴定收集河北医科大学第二医院整形美容科重睑术后切除的正常眼睑组织,采用贴壁法原代细胞培养。培养的成纤维细胞传至3代后,爬片固定,采用形态学观察及鼠抗人波形蛋白单克隆抗体、鼠抗角蛋白单克隆抗体对培养出的细胞进行鉴定。2. 筛选UVA照射剂量,建立光损伤模型以UVA照射剂量分别为5J/cm~2、10J/cm~2、20J/cm~2、30J/cm~2,照射人皮肤成纤维细胞(HDFs),照射结束后在培养皿中加入完全培养液(含双抗的10%胎牛血清的低糖DMEM液)培养培养24h,对照组、UVA组细胞,分别于倒置显微镜下观察照射后即刻及照射后培养24h形态学变化。MTT法检测细胞增值率,选出适宜本实验建立细胞光损伤模型的照射剂量。3.CGF作用浓度筛选将含CGF(浓度分别为5%、10%、20%、30%)的完全培养液作用于UVA损伤的HDFs,对照组、UVA+CGF组细胞,分别于倒置显微镜下观察照射后即刻及照射后含CGF完全培养液培养24h形态学变化。MTT法分别检测CGF作用24h、48h、72h后细胞增值率,筛选出最佳CGF作用浓度。4.实验分组根据实验要求,将细胞分为以下三组:空白对照组:HDFs经UVA假照射(细胞处理过程同以下两组,但无UVA照射)后完全培养液培养24h。UVA组:HDFs经20J/cm~2的UVA照射后完全培养液培养24h。UVA+CGF组:HDFs经20J/cm~2的UVA照射后含20%浓度CGF的完全培养液培养24h。5.细胞内活性氧簇(ROS)含量观察及检测2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)标记三组HDFs,倒置荧光显微镜暗视野下观察细胞内荧光强度;流式细胞术检测细胞内ROS含量。6.细胞内P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、c-Jun氨基端激酶、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)检测。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)??C_T相对定量法检测P38MAPK、c-jun及MMP-1 m RNA在细胞内的表达水平;蛋白免疫印记(Western Blot)法检测细胞内P38MAPK、c-jun、MMP-1蛋白表达。7.统计学分析采用SPSS21.0统计软件进行分析,各组数据以均数±标准差(?x±s)的形式表示,计量资料正态方差齐采用单因素方差分析,方差不齐采用非参数检验。应用SNK-t检验比较三组数据差异,检验水准a=0.05,P<0.05,差异有显著性。结果:1.人皮肤成纤维细胞的原代培养和鉴定人眼睑皮肤组织块培养5-7d,可见细胞自组织块周围爬出,细胞胞体大,为多突纺锤形或星形扁平细胞,细胞核呈规则卵圆形,核仁较大且明显。继续培养3-4天,细胞在组织块周围呈放射状生长。免疫细胞化学染色结果显示,细胞抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性。2.不同处理组HDFs形态学观察未照射组HDFs:细胞形态完整、紧密连接、呈放射状规则排列。UVA照射后HDFs:照射后即刻观察可见细胞肿胀、破裂、少量细胞悬浮,完全培养液培养24h后观察可见细胞碎片和悬浮细胞数增多、细胞排列不规则。CGF处理组HDFs:20%CGF培养液24h后与UVA组比较,HDFs形态较规则,萎缩程度小,悬浮细胞数量少。3. 筛选UVA辐照剂量,建立光老化模型MTT结果显示:与未照射组光密度(OD)值比较,10J/cm~2、20J/cm~2、30J/cm~2的UVA照射组OD值差异具有统计学意义(P<0.05)。相应的细胞存活率为91%、84%、64%、41%。我们选取20J/cm~2为本实验光老化建模的UVA照射剂量4. CGF作用浓度筛选。MTT结果显示,未照射组、照射组及CGF处理组HDFs在培养后的24h,48h,72h的光密度OD值均增高。与20J/cm~2的UVA照射组OD值相比,未照射组及CGF处理OD值差异具有统计学意义(P<0.05)。其中在CGF处理组中,浓度为20%的CGF促进细胞增值的效果最佳。5. ROS表达观察及含量的检测倒置荧光显微镜观察,空白对照组细胞荧光强度最弱,UVA组细胞荧光强度显著增加,ROS高表达,UVA+CGF组细胞荧光强度较UVA组降低,CGF抑制细胞ROS表达。流式细胞术结果显示:空白对照组、UVA组,UVA+CGF组的平均荧光强度分别为3.963±0.775,7.800±0.300,5.673±0.579,各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。6. P38MAPK、c-jun、MMP-1表达RT-PCR结果显示,UVA组P38MAPK、c-jun、MMP-1 m RNA表达较空白对照组分别上升6.346、6.246、3.070倍,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。UVA+CGF组P38MAPK、c-jun、MMP-1 m RNA较空白对种组分别上调3.783、1.563、1.989倍,与未照射组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。UVA组与UVA+CGF组m RNA相对表达量比较差异有统计学意义(P>0.05)。Western blot检测结果显示,UVA组P38MAPK、c-jun、MMP-1蛋白含量表达最高,与空白对照组及UVA+CGF组比差异具有统计学意义(P<0.05),UVA+CGF组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.CGF可促进UVA诱导的光老化HDFs增殖。2.CGF可能通过减少UVA诱导的光老化HDFs内ROS的产生、从而减轻细胞氧化损伤。3.CGF抑制UVA所致HDFs损伤,可能通过抑制P38MAPK/AP-1信号通路、减少MMP-1表达来实现。