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杨树是重要的造林用材与平原绿化树种,也是林木基础研究的模式树种。毛白杨是杨树基础应用研究与生产栽培的典型代表,在林木遗传改良、分子育种、生理生化和快速繁育等基础理论与应用方面已有深入研究;然而,其在类胡萝卜素异构酶CRTISO的克隆与功能研究,尤其cis-ABA、trans-ABA两种异构体的转化方面的研究未见报道。本研究主要为毛白杨类胡萝卜素异构酶(CRTISO)基因克隆与酶活分析及其cis-ABA的异构与功能分析。本研究从五个方面对毛白杨的基因组中的CRTISO(类胡萝卜素异构酶)进行了研究,并取得一定的结果与进展:一、基因克隆与结构理论分析:首次克隆得到CRTISO cDNA全长序列,基因在NCBI Genbank上的登陆号为KX227459.1,并依据基因序列对PtCRTISO进行生物信息学分析,其基因全长为1842bp,编码氨基酸613个,与已验证功能的CRTISO序列进行同源序列比对,一致性为84.76%,预测其编码的蛋白质分子量为67.4kDa,属于亲水性蛋白,二级结构预测结果显示α-螺旋的数量为16,β-折叠为20,使用了 Discovery Studio进行分子结构模拟与底物对接分析,获得了cis-ABA、trans-ABA对接成功的结果,表明该蛋白理论上能结合cis-ABA、trans-ABA,为其催化活性分析奠定了分子结构基础;二、离体(in vitro)大肠杆菌原核高效表达研究:为研究PtCRTISO的离体(in vitro)酶活,将PtCRTISO基因构建大肠杆菌原核高效体系(六种表达体系)进行表达蛋白质并进行纯化,目的蛋白均以包涵体形式存在,未获得大量的可溶性蛋白质;为顺利进行PtCRTISO的体外酶活功能验证,本研究建立了目的基因的原核与酵母表达体系、植物表达体系。三、离体(in viro)酵母真核高效表达活性研究:构建真核酵母高效表达载体,改进其表达可溶性,最终获得了可溶性蛋白,以cis-ABA为底物,利用毕赤酵母GS1 15表达得到目的蛋白,产物为trans-ABA。并对其光异构活性进行了比较研究,排除了其异构是光异构的可能与化学异构的可能,完全证明其异构为酶学异构,对目的蛋白进行酶学活性进行研究,得到PtCRTISO最适反应温度是30℃,最适反应pH为6.7,拟合Km值为0.3763nM。四、构建了植物表达载体并转化植物(in vivo):在in vitro离体活性与酶学特性研究的基础上,为证明其活体活性和功能,将PtCRTISO基因构建植物表达载体pBI121-PtCRTISO,并对模式植物拟南芥和烟草进行了农杆菌浸染转化,获得了转基因植物,在模式植物烟草中验证其功能。结果显示,在转基因烟草中PtCRTISO基因表达量明显升高,产物trans-ABA积累量升高,在烟草活体中证明PtCRTISO的功能。采集毛白杨四季的叶片,进行qPCR与ABA含量检测,结果表明PtCRTISO基因表达量与ABA的顺反比值变化趋势一致,进一步证明PtCRTISO对于ABA的顺反异构具有催化活性。另外本研究为了准确检测酶活反应与植物样品中的cis-ABA、trans-ABA含量,建立了基于HPLC-MS/MS的分析方法,并将其完善,能够同时高效检测多种植物激素。针对ABA前体萜烯类物质建立了基于GC-MS的分析方法。五、PtCRTISO的底物为cis-ABA,产物为trans-ABA,其检测方法较为困难,一般的酶联免疫法与分光光度计法无法区分ABA的顺反结构,本研究基于HPLC-MS/MS建立了 ABA分析方法,并且加以拓展与完善,成为能够检测全部九大类植物激素的检测方法,包括乙烯等难以检测的气体激素,并应用于多种不同种属的植物材料,证明了检测方法的适用性,为植物激素的检测及功能研究提供强有力的技术支持。另外对于ABA前体的萜烯类化合物建立了基于GC-MS的检测方法,对于研究结构较为复杂、种类繁多的萜烯类化合物提供重要参考。附录为木质素及其前体酚酸、具有药用与经济价值的酚酸以及可溶性单糖的高效检测方法,为代谢物的功能研究提供技术手段。本文通过理论模拟、离体高效表达酶蛋白试管(in vitro)活性研究以及通过植物转化植物活体(in vivo)分别对CRTISO酶活性进行研究,证明了该蛋白具有cis-ABA异构成trans-ABA的活性,并在植物体内起到了调节活性cis-ABA与非生理活性trans-ABA的比例与含量的作用,挖掘出一种新的功能。