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异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前根治白血病的唯一有效手段,但仍然存在如移植物抗宿主病(GVHD)、移植排斥和免疫重建等移植相关障碍,尤其是如何在防止GVHD的同时诱导足够强的移植物抗白血病(GVL)作用,是目前临床aUo-HSCT中亟待解决的难题。本研究针对这些影响allo-HSCT疗效的关键问题立题,建立NK细胞体外分离和培养扩增的方法和小鼠异基因骨髓移植(allo-BMT)模型,研究NK细胞在allo-HSCT中的移植免疫和抗肿瘤免疫效应及机制。实验结果证实,在小鼠allo-BMT中,同种异基因反应性NK细胞有效抑制GVHD和移植排斥,提高造血干细胞植入水平,促进造血、免疫重建并显著提高受者的生存率;并发现同种异基因反应性NK细胞对小鼠B16-F1肿瘤细胞具有明显的移植物抗肿瘤(GVT)作用。实验结果与临床alIo-HSCT中亟需攻克的关键障碍紧密相关,不仅对NK细胞效应机制的研究具有重要的理论意义,而且对NK细胞应用于allo-HSCT和治疗异基因肿瘤的临床实践有重要的指导作用。俘舍攀悦论文:.移带价细砚在刁、双异玉因开倪移祖中作用及其机侧的研究中大摘界效靶细胞25:1时杀伤率分别为54.38%、66.54%、79.38%、83.86%,明显高于脾MNC(41.01%)。MACS法纯化前后细胞总数和CD3一NKI.1+细胞百分率分别为l.oxl08、l.sxlo‘和2.54%、93.60%;但纯化后细胞在体外培养20d只扩增到1.9xl扩。结论:用两步猫附分离法扩增并分离小鼠NK细胞,2~3周内可获得大量NK细胞,纯度达55%~60%;效靶细胞为25:1时对YAC一1细胞的杀伤率约为80%。 第二章小鼠异基因骨髓移植急性移植物抗宿主病模型的建立 目的:建立稳定可靠的小鼠异基因骨髓移植急性移植物抗宿主病(GVHD)模型;为异基因骨髓移植中GVHD研究提供理想的实验参照。方法:以近交系的c57BL/6(H-Zb小鼠为供鼠、BALB/c似一2勺小鼠为受鼠进行异基因骨髓移植,在移植物中混合不同比例的供鼠外周淋巴细胞以引起不同程度的GVHD。根据临床表现、存活期及病理检查等判断GVHD程度。结果:单纯异基因骨髓组只有部分小鼠出现急性GVHD,20Ok的小鼠长期存活(超过120天),无急性GVHD表现;混合不同比例外周淋巴细胞的异基因骨髓移植小鼠出现GVHD的时间和程度均有差异,其中骨髓细胞4xlo“与外周淋巴细胞1:1混合组小鼠全部在移植后5~14天出现典型的弓背体位,存活期6~24天,临床和病理均可在相对集中的时间内观察到典型的急性GVHD改变。结论:以供鼠骨髓细胞4、106与外周淋巴细胞1:1混合进行的异基因骨髓移植,100%引出致死性的急性GVHD。第三章NK细胞对小鼠异基因骨髓移植中GVHD效应的影响 目的:研究自然杀伤仍服)细胞在异基因骨髓移植(all。一BMT)中对移植物抗宿主病(GVHD)的影响。方法:以近交系小鼠c57BL/6(H一Zb为供鼠、BALB/c(H-Zd)为受鼠进行allo-BMT,在allo-BMT同时输入不同数量的供鼠外周T细胞和(或)NK细胞,根据临床表现和病理检查判断GVHD程度,并比较不同移植组的存活率和GVHD发生情况。结果:输注lxl06供鼠NK细胞的移植组40%小鼠出现GV}ID,输注2 x 106供鼠NK细胞的移植组仅30%出现GVHD,输注NK细胞的两组分别与异基因骨髓移植组(80%急性GVHD、20%慢性GVHD)和骨髓+T细胞组(100%急性GvHD)比较,GVHD发生率显著下降、程度明显减轻;长俘士拳悦论文:.落杀价翻硬在小双葬王因.从移植甲他用及其祝侧的研充甲文摘葬期存活(超过120天)率在输注高浓度NK细胞组为80%,输注低浓度NK细胞组为70%,均较异基因骨髓移植组(20%)和骨髓+T细胞组(0 .0%)显著增高伊<0.01)。结论:在小鼠all。一BMT中,同种异基因反应性NK细胞可抑制GvHD效应,延长存活期。第四章NK细胞在小鼠异基因骨髓移植模型中抗肿瘤作用的研究 目的:利用小鼠异基因骨髓移植(all。一BM叮)模型,研究同种异基因反应性NK细胞对B 16-FI和S一180肿瘤细胞成瘤小鼠的移植物抗肿瘤(GvT)作用。方法:用B16一Fl和s一180细胞株分别在近交系的c57BL/6(H一Zb和BALB/c(H一2与小鼠建立肿瘤模型。以接受致死量全身照射(,D的荷瘤小鼠为受鼠,分别以BALBlc件2与和c57B珑似一扔小鼠为供鼠进行allo-BMT,并在all。一B研后输注供鼠外周T细胞或NK细胞治疗肿瘤,比较不同组的成瘤情况、抑瘤率和20天存活率,并根据临床表现、白细胞计数和病理检查判断受鼠是否死于GVHD或骨髓造血功能衰竭。结果:对S一180细胞成瘤受鼠,各组的抑瘤率和加天存活率无差异,全部受鼠在移植后17天内死亡;其中T细胞治疗组小鼠有急性GVHD表现。对B16-FI细胞成瘤受鼠,NK细胞治疗组的抑瘤率(71.05%)和20天存活率(100%)显著高于单纯骨髓移植组(46.58%和50%),NK细胞治疗组和单纯骨髓移植组的20天存活率均高于不接受扭I和aU。一BMT的生物对照组0.0%),且无GVHD表现;而T细胞治疗组小鼠全部移植十9~十15死于急性GVHD。结论:在小鼠ail小BMT中,同种异基因反应性NK细胞对B16一Fl肿瘤细胞有显著GVT作用而且不引起GVHD效应,可以延长荷瘤受鼠的生存期;对S一180肿瘤细胞,同种异基因反应性NK细胞无GVT作用。 第五章NK细胞对异基因骨髓移植中移植排斥 和造血及免疫重建的影响 目的:研究自然杀伤价服)细胞在小鼠异基因骨髓移植(a no一BMT)中?