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研究目的 CLEC18A(c-type lectin domain family 18,member A)是新发现的广泛表达于单核巨噬细胞、T细胞、B细胞和粒细胞上的一种C型凝集素糖蛋白。以往研究发现单核巨噬细胞的培养上清中可检测到CLEC18A表达,但其在脓毒症及对巨噬细胞炎症反应的作用尚未有相关报道。本研究旨在初步探讨CLEC18A在脓毒症炎症反应中的作用,以及其对巨噬细胞炎症反应的调控作用和可能的机制。研究方法 1.CLEC18A在脓毒症患者及LPS刺激的巨噬细胞中的表达1)临床样本:收集临床脓毒症患者、同一手术类型的非脓毒症患者及健康志愿者的血液样本,检测血清中CLEC18A浓度和外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中CLEC18A的m RNA水平;分离培养健康志愿者PBMC,检测LPS刺激下培养上清中CLEC18A水平。2)离体实验:提取小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,PM),检测LPS刺激PM后CLEC18A的m RNA水平和培养上清中CLEC18A水平。2.外源性CLEC18A对小鼠脓毒症及巨噬细胞炎症反应的影响1)体内实验:小鼠随机分为:空白对照组、LPS组(10mg/kg腹腔注射)、r CLEC18A(80μg/kg)组和LPS+r CLEC18A(20、40、80μg/kg)组,处理6小时后检测小鼠血清IL-6和TNF-α水平。2)离体实验:提取小鼠PM和骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMDM),分别分组:空白对照组、LPS(100ng/ml)、r CLEC18A组(40ng/ml)、LPS+r CLEC18A(5、10、20、40ng/ml)组,检测细胞培养上清中IL-6和TNF-α水平。3.体外敲减和髓系缺失小鼠验证CLEC18A在体内和体外的作用 1)体内实验:采用CLEC18A髓系特异性条件敲除(CLEC18A Lyz-cre)的小鼠及同窝对照小鼠构建盲肠结扎穿孔(cecal ligation&puncture,CLP)脓毒症模型,观察CLP小鼠生存率,并检测建模12h时小鼠血清IL-6和TNF-α水平;构建LPS腹腔注射模型,检测建模6h时小鼠血清IL-6和TNF-α水平。2)离体实验:提取小鼠PM,脂质体转染CLEC18A特异性si RNA,LPS(100ng/ml)刺激1h、3h和6h,检测刺激1h和3h时细胞IL-6和TNF-α的m RNA水平以及刺激6h时细胞培养上清中IL-6和TNF-α水平;PM行上述si RNA干扰CLEC18A,检测外源性补充r CLEC18A重组蛋白后LPS刺激下细胞培养上清中IL-6和TNF-α水平;提取CLEC18A Lyz-cre小鼠的PM,体外LPS(100ng/ml)刺激6h,检测细胞培养上清中IL-6和TNF-α水平。4.CLEC18A的表达调控及抑炎机制的初步探讨1)表达调控机制探讨:体外培养PM,加入JNK、ERK、p38-MAPK或p65的特异性抑制剂,检测LPS刺激3h或6h时细胞CLEC18A的m RNA表达水平;PM细胞按照上述处理,检测LPS刺激1h或3h时培养上清中CLEC18A的蛋白质水平。2)抑炎机制探讨:分离培养PM,si RNA脂质体法干扰CLEC18A表达,分离培养CLEC18ALyz-cre小鼠PM,检测两种细胞LPS刺激后JNK、ERK、p38、p65信号分子磷酸化水平;分离培养PM及BMDM,外源给予r CLEC18A后,检测LPS刺激后上述信号分子磷酸化水平。研究结果1.脓毒症患者血清CLEC18A水平及PBMC中CLEC18A的m RNA水平较非脓毒症术后患者升高;健康志愿者PBMC在LPS刺激下,CLEC18A表达升高;小鼠PM和BMDM在LPS刺激后CLEC18A的m RNA在1小时达到表达高峰,细胞培养上清中CLEC18A水平随时间累积性上升。2.外源给予CLEC18A可降低LPS诱发的小鼠血清炎症因子IL-6和TNF-α水平并可抑制LPS刺激的巨噬细胞IL-6及TNF-α的产生。3.髓系敲除CLEC18A的小鼠生存率显著降低,其12h时血清中IL-6和TNF-α水平升高;LPS腹腔注射后6h时,敲除小鼠血清IL-6和TNF-α水平升高;干扰CLEC18A表达或髓系敲除CLEC18A的小鼠巨噬细胞在LPS刺激后IL-6及TNF-α的m RNA及其蛋白质水平显著上升。4.ERK及JNK抑制剂预处理可降低LPS诱导的巨噬细胞CLEC18A的m RNA及其蛋白质水平;干扰CLEC18A表达或髓系敲除CLEC18A时,LPS刺激下PM中MAPK/NF-k B信号通路中p65、JNK、ERK和p38蛋白的磷酸化水平显著上调;外源性给予CLEC18A则导致PM以及BMDM中上述分子磷酸化水平下降。研究结论脓毒症时CLEC18A表达上调,可减轻巨噬细胞炎症反应,并对脓毒症小鼠具有一定保护作用。CLEC18A可能主要通过JNK/ERK信号通路激活表达,抑制MAPK/NF-k B信号通路的激活,进而抑制巨噬细胞炎症反应。本研究初步提示了CLEC18A这种新型负性调控因子在脓毒症炎症反应中可能的作用及其相关机制,进一步拓展了人们对脓毒症调控网络的认识与理解。